Modificaciones de la cromatina y splicing alternativo en la terapia de la atrofia muscular espina l : estrategias dirigidas de CRISPR-dCas9 y oligonucleótidos antisentido

Autores
Stigliano, José Nicolás
Año de publicación
2025
Idioma
español castellano
Tipo de recurso
tesis doctoral
Estado
versión publicada
Colaborador/a o director/a de tesis
Kornblihtt, Alberto Rodolfo
Descripción
La presente tesis aborda de manera exhaustiva el estudio de la regulación del splicing alternativo, con un enfoque en la inclusión del exón 7 del gen SMN2, relevante en el contexto de la atrofia muscular espinal (AME). A lo largo de esta investigación, se exploraron múltiples estrategias para modular la inclusión de este exón, empleando tanto tecnologías clásicas como novedosas. Se llevó a cabo un análisis detallado del impacto de las modificaciones epigenéticas y del estado de la cromatina en el proceso de inclusión del exón 7 en el RNA mensajero maduro. Los experimentos demostraron que la pérdida de metiltransferasas de histonas como G9a y la eliminación de proteínas de heterocromatina como HP1β aumentan la inclusión del exón 7 y potencian la eficacia de los tratamientos basados en oligonucleótidos antisentido (ASOs). Estos resultados subrayan la importancia del estado de la cromatina en la regulación del splicing y abren la puerta a terapias combinadas que integren moduladores de la cromatina con ASOs para mejorar los resultados terapéuticos. Se emplearon herramientas avanzadas de edición génica, como CRISPR-dCas9, para realizar modulaciones dirigidas de la cromatina sin alterar de manera permanente la secuencia del DNA. La utilización de dCas9 fusionada a activadores transcripcionales como VP64 demostró ser una estrategia eficaz para mejorar la inclusión del exón 7 de SMN2, superando las limitaciones de los fármacos pleiotrópicos como los inhibidores de histona deacetilasas (HDACi, e.g., ácido valproico). Esta metodología permite una modulación específica y reversible de los eventos transcripcionales, lo que tiene implicaciones significativas en la búsqueda de terapias personalizadas para la AME y otras enfermedades genéticas. La investigación también se centró en la aplicación de técnicas de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) para mapear los cambios en la estructura cromatínica y su relación con los niveles de inclusión del exón 7. Estos análisis revelaron una correlación entre la presencia de marcas epigenéticas asociadas a un estado de cromatina abierta, como la acetilación de lisinas en la histona H3 (H3Kac), la activación del promotor del gen SMN2 y splicing del exón 7 del mismo, lo que sugiere un vínculo directo entre la regulación epigenética y el procesamiento del RNA mensajero. Además, se comprobó que los tratamientos con oligonucleótidos antisentido (ASOs) inducen modificaciones de la cromatina, las cuales pueden ser moduladas mediante combinaciones de fármacos y herramientas epigenéticas específicas. Paralelamente, el uso de técnicas de captura de conformación cromosómica (3C) permitió identificar interacciones entre la región promotora 5’ y la región 3’ del gen SMN2. Se observó que dichas interacciones se alteraron dinámicamente tras el tratamiento con ASOs y CRISPR/dCas9-VP64, lo que respalda los efectos observados en la activación transcripcional, splicing y el estado cromatínico en estos tratamientos. En conjunto, esta tesis propone no solo un potencial enfoque innovador para el tratamiento de la AME, sino que también revela mecanismos moleculares, hasta el presente desconocidos, que gobiernan las interacciones funcionales y físicas entre cromatina, transcripción y splicing alternativo.
This thesis explores the regulation of alternative splicing with a focus on the inclusion of exon 7 of the SMN2 gene, a critical element in the pathology of spinal muscular atrophy (SMA). By employing a combination of classical and innovative techniques, the research investigates how chromatin modifications and the epigenetic landscape influence splicing and therapeutic efficacy. Key findings demonstrate that the loss of histone methyltransferases, such as G9a, and the depletion of heterochromatin proteins like HP1β enhance the inclusion of SMN2 exon 7 and increase the sensitivity to antisense oligonucleotide (ASO) therapies. These results emphasize the significant role of chromatin state in modulating splicing events and support the potential of combined approaches that integrate chromatin modulators with ASOs for improved treatment outcomes. The study also applied cutting-edge CRISPR-dCas9 technology to achieve targeted chromatin modulation without permanent changes to the DNA sequence. The use of dCas9 fused to transcriptional activators, such as VP64, proved effective in increasing exon 7 inclusion, addressing limitations associated with pleiotropic drugs like HDAC inhibitors (e.g., valproic acid). This approach allows for specific and reversible modulation of transcriptional processes, underscoring its implications for personalized therapies in SMA and other genetic disorders. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments were employed to map changes in chromatin structure and link them to SMN2 exon 7 inclusion. These analyses highlighted the connection between chromatin marks associated with an open chromatin state, such as H3 lysine acetylation (H3Kac), promoter activation, and the splicing of SMN2 exon 7. Furthermore, the study confirmed that ASO treatment can induce chromatin modifications that can be strategically modulated using specific epigenetic tools and pharmacological agents. Additionally, a chromosomal conformation capture (3C) technique was used to identify interactions between the 5’ promoter region and the 3’ region of the SMN2 gene. These interactions were found to be dynamically altered following treatment with ASOs and CRISPR/dCas9-VP64, further supporting the observed effects on transcriptional activation, splicing, and chromatin state. Together, this work proposes not only a potential novel strategy for the treatment of SMA, but also reveals underlying molecular mechanisms that govern functional interactions between chromatin, transcription and alternative splicing.
Fil: Stigliano, José Nicolás. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.
Materia
SPLICING ALTERNATIVO
ATROFIA MUSCULAR ESPINAL (AME)
MODULACION EPIGENETICA
CROMATINA
OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO (ASO)
CRISPR-dCas9
ALTERNATIVE SPLICING
SPINAL MUSCULAR ATROPHY (SMA)
EPIGENETIC MODULATION
CHROMATIN
ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES
CRISPR-dCas9
Nivel de accesibilidad
acceso abierto
Condiciones de uso
https://creativecommons.org/licenses/by-nd/2.5/ar
Repositorio
Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
Institución
Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
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Estos análisis revelaron una correlación entre la presencia de marcas epigenéticas asociadas a un estado de cromatina abierta, como la acetilación de lisinas en la histona H3 (H3Kac), la activación del promotor del gen SMN2 y splicing del exón 7 del mismo, lo que sugiere un vínculo directo entre la regulación epigenética y el procesamiento del RNA mensajero. Además, se comprobó que los tratamientos con oligonucleótidos antisentido (ASOs) inducen modificaciones de la cromatina, las cuales pueden ser moduladas mediante combinaciones de fármacos y herramientas epigenéticas específicas. Paralelamente, el uso de técnicas de captura de conformación cromosómica (3C) permitió identificar interacciones entre la región promotora 5’ y la región 3’ del gen SMN2. 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Key findings demonstrate that the loss of histone methyltransferases, such as G9a, and the depletion of heterochromatin proteins like HP1β enhance the inclusion of SMN2 exon 7 and increase the sensitivity to antisense oligonucleotide (ASO) therapies. These results emphasize the significant role of chromatin state in modulating splicing events and support the potential of combined approaches that integrate chromatin modulators with ASOs for improved treatment outcomes. The study also applied cutting-edge CRISPR-dCas9 technology to achieve targeted chromatin modulation without permanent changes to the DNA sequence. The use of dCas9 fused to transcriptional activators, such as VP64, proved effective in increasing exon 7 inclusion, addressing limitations associated with pleiotropic drugs like HDAC inhibitors (e.g., valproic acid). This approach allows for specific and reversible modulation of transcriptional processes, underscoring its implications for personalized therapies in SMA and other genetic disorders. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments were employed to map changes in chromatin structure and link them to SMN2 exon 7 inclusion. These analyses highlighted the connection between chromatin marks associated with an open chromatin state, such as H3 lysine acetylation (H3Kac), promoter activation, and the splicing of SMN2 exon 7. Furthermore, the study confirmed that ASO treatment can induce chromatin modifications that can be strategically modulated using specific epigenetic tools and pharmacological agents. Additionally, a chromosomal conformation capture (3C) technique was used to identify interactions between the 5’ promoter region and the 3’ region of the SMN2 gene. 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This thesis explores the regulation of alternative splicing with a focus on the inclusion of exon 7 of the SMN2 gene, a critical element in the pathology of spinal muscular atrophy (SMA). By employing a combination of classical and innovative techniques, the research investigates how chromatin modifications and the epigenetic landscape influence splicing and therapeutic efficacy. Key findings demonstrate that the loss of histone methyltransferases, such as G9a, and the depletion of heterochromatin proteins like HP1β enhance the inclusion of SMN2 exon 7 and increase the sensitivity to antisense oligonucleotide (ASO) therapies. These results emphasize the significant role of chromatin state in modulating splicing events and support the potential of combined approaches that integrate chromatin modulators with ASOs for improved treatment outcomes. The study also applied cutting-edge CRISPR-dCas9 technology to achieve targeted chromatin modulation without permanent changes to the DNA sequence. The use of dCas9 fused to transcriptional activators, such as VP64, proved effective in increasing exon 7 inclusion, addressing limitations associated with pleiotropic drugs like HDAC inhibitors (e.g., valproic acid). This approach allows for specific and reversible modulation of transcriptional processes, underscoring its implications for personalized therapies in SMA and other genetic disorders. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments were employed to map changes in chromatin structure and link them to SMN2 exon 7 inclusion. These analyses highlighted the connection between chromatin marks associated with an open chromatin state, such as H3 lysine acetylation (H3Kac), promoter activation, and the splicing of SMN2 exon 7. Furthermore, the study confirmed that ASO treatment can induce chromatin modifications that can be strategically modulated using specific epigenetic tools and pharmacological agents. Additionally, a chromosomal conformation capture (3C) technique was used to identify interactions between the 5’ promoter region and the 3’ region of the SMN2 gene. These interactions were found to be dynamically altered following treatment with ASOs and CRISPR/dCas9-VP64, further supporting the observed effects on transcriptional activation, splicing, and chromatin state. Together, this work proposes not only a potential novel strategy for the treatment of SMA, but also reveals underlying molecular mechanisms that govern functional interactions between chromatin, transcription and alternative splicing.
Fil: Stigliano, José Nicolás. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.
description La presente tesis aborda de manera exhaustiva el estudio de la regulación del splicing alternativo, con un enfoque en la inclusión del exón 7 del gen SMN2, relevante en el contexto de la atrofia muscular espinal (AME). A lo largo de esta investigación, se exploraron múltiples estrategias para modular la inclusión de este exón, empleando tanto tecnologías clásicas como novedosas. Se llevó a cabo un análisis detallado del impacto de las modificaciones epigenéticas y del estado de la cromatina en el proceso de inclusión del exón 7 en el RNA mensajero maduro. Los experimentos demostraron que la pérdida de metiltransferasas de histonas como G9a y la eliminación de proteínas de heterocromatina como HP1β aumentan la inclusión del exón 7 y potencian la eficacia de los tratamientos basados en oligonucleótidos antisentido (ASOs). Estos resultados subrayan la importancia del estado de la cromatina en la regulación del splicing y abren la puerta a terapias combinadas que integren moduladores de la cromatina con ASOs para mejorar los resultados terapéuticos. Se emplearon herramientas avanzadas de edición génica, como CRISPR-dCas9, para realizar modulaciones dirigidas de la cromatina sin alterar de manera permanente la secuencia del DNA. La utilización de dCas9 fusionada a activadores transcripcionales como VP64 demostró ser una estrategia eficaz para mejorar la inclusión del exón 7 de SMN2, superando las limitaciones de los fármacos pleiotrópicos como los inhibidores de histona deacetilasas (HDACi, e.g., ácido valproico). Esta metodología permite una modulación específica y reversible de los eventos transcripcionales, lo que tiene implicaciones significativas en la búsqueda de terapias personalizadas para la AME y otras enfermedades genéticas. La investigación también se centró en la aplicación de técnicas de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) para mapear los cambios en la estructura cromatínica y su relación con los niveles de inclusión del exón 7. Estos análisis revelaron una correlación entre la presencia de marcas epigenéticas asociadas a un estado de cromatina abierta, como la acetilación de lisinas en la histona H3 (H3Kac), la activación del promotor del gen SMN2 y splicing del exón 7 del mismo, lo que sugiere un vínculo directo entre la regulación epigenética y el procesamiento del RNA mensajero. Además, se comprobó que los tratamientos con oligonucleótidos antisentido (ASOs) inducen modificaciones de la cromatina, las cuales pueden ser moduladas mediante combinaciones de fármacos y herramientas epigenéticas específicas. Paralelamente, el uso de técnicas de captura de conformación cromosómica (3C) permitió identificar interacciones entre la región promotora 5’ y la región 3’ del gen SMN2. Se observó que dichas interacciones se alteraron dinámicamente tras el tratamiento con ASOs y CRISPR/dCas9-VP64, lo que respalda los efectos observados en la activación transcripcional, splicing y el estado cromatínico en estos tratamientos. En conjunto, esta tesis propone no solo un potencial enfoque innovador para el tratamiento de la AME, sino que también revela mecanismos moleculares, hasta el presente desconocidos, que gobiernan las interacciones funcionales y físicas entre cromatina, transcripción y splicing alternativo.
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