Análisis estructural y funcional del receptor de glucocorticoides en sus múltiples interacciones

Autores
Alves, Norma Roxana Carina
Año de publicación
2023
Idioma
español castellano
Tipo de recurso
tesis doctoral
Estado
versión publicada
Colaborador/a o director/a de tesis
Pecci, Adalí
Alvarez, Lautaro Damián
Descripción
En esta Tesis se exploran los mecanismos moleculares involucrados en la interacción entre el receptor de glucocorticoides (GR), un factor de transcripción activado por ligando, y varios de los interactores que participan en su actividad transcripcional. En primer lugar, se emplearon métodos computacionales (simulación por dinámica molecular) para descifrar los mecanismos de acción del agonismo y del antagonismo en el dominio de unión al ligando utilizando los compuestos comerciales dexametasona (glucocorticoide) y mifepristona (antiglucocorticoide), caracterizando el comportamiento dinámico de la hélice 12 del receptor y su relación con la identidad del ligando. En segundo lugar, se investigó la interacción del GR con correguladores de la transcripción mediante el uso de tecnología de microarrays, dirigido a evaluar afinidades de unión GR-corregulador en presencia de diferentes ligandos. Aplicando métodos de docking péptido-proteína también se analizaron los determinantes moleculares involucrados en este reconocimiento. En tercer y último lugar, se abordó el estudio de la interacción cruzada entre el GR y el receptor de progesterona (PR), factor de transcripción de la misma familia proteica. Empleando ensayos de genes reporteros, se evaluó la actividad transcripcional al activar cada receptor por separado o ambos a la vez, y se comprobó la interferencia funcional GR/PR. Luego, mediante microscopía de fluorescencia de alta resolución en células vivas, se estudió y corroboró la capacidad de ambos receptores de formar parte de un mismo complejo. Asimismo, se caracterizó el estado de oligomerización del GR en presencia de PR, observando también interferencia en este caso. En conjunto, estos resultados refuerzan la idea de que PR y GR podrían formar heterocomplejos. Finalmente, se realizó un estudio in silico del hipotético heterecomplejo mediante simulaciones por dinámica molecular de homo- y heterodímeros de los dominios de unión al ADN de PR y GR, corroborando su estabilidad estructural e identificando factores que podrían explicar su menor actividad transcripcional. El conjunto de los resultados obtenidos en esta Tesis permiten ampliar los conocimientos existentes sobre la estructura y función del receptor de glucocorticoides en diferentes contextos y en relación a los múltiples interactores que regulan su actividad: ligandos, correguladores y otros factores de transcripción y contribuyen a la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a las acciones fisiológicas y farmacológicas de los GC.
This Thesis explores the molecular mechanisms involved in the interaction between the glucocorticoid receptor (GR), a ligand-activated transcription factor, and several interactors involved in its transcriptional activity. First, computational methods (molecular dynamics simulation) were employed to decipher the mechanisms of action of agonism and antagonism in the ligand binding domain using the commercial compounds dexamethasone (glucocorticoid) and mifepristone (antiglucocorticoid), characterizing the dynamic behavior of helix 12 of the receptor and its relationship with ligand identity. Second, the interaction of GR with transcriptional coregulators was investigated using a microarray assay, aimed at evaluating GR-coregulator binding affinities in the presence of different ligands. The molecular determinants involved in this recognition were also assessed by applying peptide-protein docking methods. Finally, the crosstalk between the GR and progesterone receptor (PR), a transcription factor of the same protein family, was addressed. Through reporter gene assays, transcriptional activity was evaluated by activating each receptor separately or simultaneously and functional GR/PR interference was confirmed. Using high-resolution fluorescence microscopy in live cells, the ability of both receptors to form part of the same complex was studied and corroborated. Likewise, the oligomerization state of GR in the presence of PR was characterized, and interference was observed. Taken together, these results reinforce the hypothesis that PR and GR can form heterocomplexes. Finally, an in silico study of the hypothetical heterocomplex was performed using molecular dynamics simulations of homo- and heterodimers of the DNA-binding domains of PR and GR, corroborating their structural stability and identifying factors that could explain their lower transcriptional activity. The set of results obtained in this Thesis extends the existing knowledge on the structure and function of the glucocorticoid receptor in different contexts and in relation to the multiple interactors that regulate its activity, including ligands, co-regulators, and other transcription factors, and contributes to the understanding of the molecular mechanisms underlying the physiological and pharmacological actions of GCs.
Fil: Alves, Norma Roxana Carina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.
Materia
GLUCOCORTICOIDES
RECEPTOR DE GLUCOCORTICOIDES
SIMULACION POR DINAMICA MOLECULAR
CORREGULADORES
DOCKING
MICROSCOPIA DE FLURESCENCIA
RECEPTOR DE PROGESTERONA
GLUCOCORTICOIDS
GLUCOCORTICOUD RECEPTOR
MOLECULAR DYNAMICS SIMULATION
COREGULATORS
DOCKING
FLUORESCENCE MICROSCOPY
PROGESTERONE RECEPTOR
Nivel de accesibilidad
acceso abierto
Condiciones de uso
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar
Repositorio
Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
Institución
Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
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En primer lugar, se emplearon métodos computacionales (simulación por dinámica molecular) para descifrar los mecanismos de acción del agonismo y del antagonismo en el dominio de unión al ligando utilizando los compuestos comerciales dexametasona (glucocorticoide) y mifepristona (antiglucocorticoide), caracterizando el comportamiento dinámico de la hélice 12 del receptor y su relación con la identidad del ligando. En segundo lugar, se investigó la interacción del GR con correguladores de la transcripción mediante el uso de tecnología de microarrays, dirigido a evaluar afinidades de unión GR-corregulador en presencia de diferentes ligandos. Aplicando métodos de docking péptido-proteína también se analizaron los determinantes moleculares involucrados en este reconocimiento. En tercer y último lugar, se abordó el estudio de la interacción cruzada entre el GR y el receptor de progesterona (PR), factor de transcripción de la misma familia proteica. Empleando ensayos de genes reporteros, se evaluó la actividad transcripcional al activar cada receptor por separado o ambos a la vez, y se comprobó la interferencia funcional GR/PR. Luego, mediante microscopía de fluorescencia de alta resolución en células vivas, se estudió y corroboró la capacidad de ambos receptores de formar parte de un mismo complejo. Asimismo, se caracterizó el estado de oligomerización del GR en presencia de PR, observando también interferencia en este caso. En conjunto, estos resultados refuerzan la idea de que PR y GR podrían formar heterocomplejos. Finalmente, se realizó un estudio in silico del hipotético heterecomplejo mediante simulaciones por dinámica molecular de homo- y heterodímeros de los dominios de unión al ADN de PR y GR, corroborando su estabilidad estructural e identificando factores que podrían explicar su menor actividad transcripcional. El conjunto de los resultados obtenidos en esta Tesis permiten ampliar los conocimientos existentes sobre la estructura y función del receptor de glucocorticoides en diferentes contextos y en relación a los múltiples interactores que regulan su actividad: ligandos, correguladores y otros factores de transcripción y contribuyen a la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a las acciones fisiológicas y farmacológicas de los GC.This Thesis explores the molecular mechanisms involved in the interaction between the glucocorticoid receptor (GR), a ligand-activated transcription factor, and several interactors involved in its transcriptional activity. First, computational methods (molecular dynamics simulation) were employed to decipher the mechanisms of action of agonism and antagonism in the ligand binding domain using the commercial compounds dexamethasone (glucocorticoid) and mifepristone (antiglucocorticoid), characterizing the dynamic behavior of helix 12 of the receptor and its relationship with ligand identity. Second, the interaction of GR with transcriptional coregulators was investigated using a microarray assay, aimed at evaluating GR-coregulator binding affinities in the presence of different ligands. The molecular determinants involved in this recognition were also assessed by applying peptide-protein docking methods. Finally, the crosstalk between the GR and progesterone receptor (PR), a transcription factor of the same protein family, was addressed. Through reporter gene assays, transcriptional activity was evaluated by activating each receptor separately or simultaneously and functional GR/PR interference was confirmed. Using high-resolution fluorescence microscopy in live cells, the ability of both receptors to form part of the same complex was studied and corroborated. Likewise, the oligomerization state of GR in the presence of PR was characterized, and interference was observed. Taken together, these results reinforce the hypothesis that PR and GR can form heterocomplexes. Finally, an in silico study of the hypothetical heterocomplex was performed using molecular dynamics simulations of homo- and heterodimers of the DNA-binding domains of PR and GR, corroborating their structural stability and identifying factors that could explain their lower transcriptional activity. The set of results obtained in this Thesis extends the existing knowledge on the structure and function of the glucocorticoid receptor in different contexts and in relation to the multiple interactors that regulate its activity, including ligands, co-regulators, and other transcription factors, and contributes to the understanding of the molecular mechanisms underlying the physiological and pharmacological actions of GCs.Fil: Alves, Norma Roxana Carina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.Universidad de Buenos Aires. 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This Thesis explores the molecular mechanisms involved in the interaction between the glucocorticoid receptor (GR), a ligand-activated transcription factor, and several interactors involved in its transcriptional activity. First, computational methods (molecular dynamics simulation) were employed to decipher the mechanisms of action of agonism and antagonism in the ligand binding domain using the commercial compounds dexamethasone (glucocorticoid) and mifepristone (antiglucocorticoid), characterizing the dynamic behavior of helix 12 of the receptor and its relationship with ligand identity. Second, the interaction of GR with transcriptional coregulators was investigated using a microarray assay, aimed at evaluating GR-coregulator binding affinities in the presence of different ligands. The molecular determinants involved in this recognition were also assessed by applying peptide-protein docking methods. Finally, the crosstalk between the GR and progesterone receptor (PR), a transcription factor of the same protein family, was addressed. Through reporter gene assays, transcriptional activity was evaluated by activating each receptor separately or simultaneously and functional GR/PR interference was confirmed. Using high-resolution fluorescence microscopy in live cells, the ability of both receptors to form part of the same complex was studied and corroborated. Likewise, the oligomerization state of GR in the presence of PR was characterized, and interference was observed. Taken together, these results reinforce the hypothesis that PR and GR can form heterocomplexes. Finally, an in silico study of the hypothetical heterocomplex was performed using molecular dynamics simulations of homo- and heterodimers of the DNA-binding domains of PR and GR, corroborating their structural stability and identifying factors that could explain their lower transcriptional activity. The set of results obtained in this Thesis extends the existing knowledge on the structure and function of the glucocorticoid receptor in different contexts and in relation to the multiple interactors that regulate its activity, including ligands, co-regulators, and other transcription factors, and contributes to the understanding of the molecular mechanisms underlying the physiological and pharmacological actions of GCs.
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