Nanoscopía de fluorescencia por localización de moléculas individuales aplicada al estudio cuantitativo de la organización espacial de proteínas

Autores
Escalante, Gonzalo
Año de publicación
2025
Idioma
español castellano
Tipo de recurso
tesis doctoral
Estado
versión publicada
Colaborador/a o director/a de tesis
Stefani, Fernando Daniel
Descripción
La organización espacial de proteínas dentro de las células constituye un determinante clave de su funcionalidad. La microscopía de súper-resolución, también conocida como nanoscopía de fluorescencia, ha constituido un avance revolucionario en este sentido al permitir visualizar la ubicación de biomoléculas con precisión nanométrica en el entorno celular. Esta tesis se enmarca en el campo de la nanoscopía de fluorescencia, específicamente en la microscopía por localización de moléculas individuales (SMLM), y desarrolla estrategias experimentales y analíticas para caracterizar cuantitativamente la organización nanométrica de proteínas en contextos biológicos complejos. Para ello, se establecieron y optimizaron rutinas integrales de adquisición, procesamiento y análisis de datos de SMLM, adaptadas a diferentes preguntas biológicas. Este enfoque se aplicó a tres sistemas diferentes, obteniendo en cada caso nuevos conocimientos sobre la organización espacial de proteínas. Primero, se caracterizó la compleja arquitectura espacial de mucinas y trans-sialidasas en Trypanosoma cruzi, descubriendo la existencia de dos poblaciones y tipos de interacción entre estas dos proteínas clave en el mecanismo de infección del parásito. Luego, se analizó la organización de la βII-espectrina en el esqueleto periódico asociado a membrana (MPS) de neuronas, confirmando en cortes de tejido de nervio ciático la periodicidad de ~190 nm entre segmentos de βII-espectrina, la cual estaba reportada solo en neuronas de cultivo. Asimismo, se descubrió una nueva regularidad interna entre dominios de βII-espectrina dentro de los anillos de espectrina. Finalmente, se estudió la distribución de la proteína Tau en neuronas humanas, identificando organizaciones diferenciales para proteínas nativas y con la mutación V337M en el gen MAPT, asociada con la demencia frontotemporal. Estos resultados aportan evidencia novedosa sobre la organización molecular en sistemas de relevancia biomédica y consolidan un marco metodológico robusto e interdisciplinario para estudios cuantitativos basados en SMLM.
The spatial organization of proteins within cells is a key determinant of their functionality. Super-resolution microscopy, also known as fluorescence nanoscopy, has revolutionized this field by enabling the visualization of biomolecules with nanometric precision in the cellular environment. This thesis lies within the framework of fluorescence nanoscopy, specifically single-molecule localization microscopy (SMLM), and develops experimental and analytical strategies to quantitatively characterize the nanometric organization of proteins in complex biological contexts. To this end, comprehensive acquisition, processing, and analysis routines for SMLM were established and optimized, tailored to different biological questions. This approach was applied to three distinct systems, yielding new insights into protein spatial organization in each case. First, the complex spatial architecture of mucins and trans-sialidases in Trypanosoma cruzi was characterized, revealing the existence of two populations and modes of interaction between these key proteins in the parasite’s infection mechanism. Second, the organization of βII-spectrin within the membrane-associated periodic skeleton (MPS) of neurons was analyzed, confirming in sciatic nerve tissue sections the ~190 nm periodicity between βII-spectrin segments previously observed in cultured neurons. Moreover, a new internal regularity of βII-spectrin domains within the rings was discovered. Finally, the distribution of Tau protein was investigated in human neurons, identifying distinct organizational patterns for native Tau and Tau comprising the V337M mutation in the MAPT gene, associated with frontotemporal dementia. These results provide novel evidence of the molecular organization of systems relevant to biomedicine and establish a robust, interdisciplinary methodological framework for quantitative studies based on SMLM.
Fil: Escalante, Gonzalo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.
Materia
NANOSCOPIA DE FLUORESCENCIA
SUPER-RESOLUCION
STORM
DNA-PAINT
BIOLOGIA ESTRUCTURAL
ORGANIZACION DE PROTEINAS
ANALISIS CUANTITATIVO
PROCESAMIENTO DE IMAGENES
NEUROBIOLOGIA MOLECULAR
TRYPANOSOMA CRUZI
FLUORESCENCE NANOSCOPY
SUPER-RESOLUTION
STORM
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STRUCTURAL BIOLOGY
PROTEIN ORGANIZATION
QUANTITATIVE ANALYSIS
IMAGE PROCESSING
MOLECULAR NEUROBIOLOGY
TRYPANOSOMA CRUZI
Nivel de accesibilidad
acceso abierto
Condiciones de uso
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar
Repositorio
Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
Institución
Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
OAI Identificador
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Esta tesis se enmarca en el campo de la nanoscopía de fluorescencia, específicamente en la microscopía por localización de moléculas individuales (SMLM), y desarrolla estrategias experimentales y analíticas para caracterizar cuantitativamente la organización nanométrica de proteínas en contextos biológicos complejos. Para ello, se establecieron y optimizaron rutinas integrales de adquisición, procesamiento y análisis de datos de SMLM, adaptadas a diferentes preguntas biológicas. Este enfoque se aplicó a tres sistemas diferentes, obteniendo en cada caso nuevos conocimientos sobre la organización espacial de proteínas. Primero, se caracterizó la compleja arquitectura espacial de mucinas y trans-sialidasas en Trypanosoma cruzi, descubriendo la existencia de dos poblaciones y tipos de interacción entre estas dos proteínas clave en el mecanismo de infección del parásito. Luego, se analizó la organización de la βII-espectrina en el esqueleto periódico asociado a membrana (MPS) de neuronas, confirmando en cortes de tejido de nervio ciático la periodicidad de ~190 nm entre segmentos de βII-espectrina, la cual estaba reportada solo en neuronas de cultivo. Asimismo, se descubrió una nueva regularidad interna entre dominios de βII-espectrina dentro de los anillos de espectrina. Finalmente, se estudió la distribución de la proteína Tau en neuronas humanas, identificando organizaciones diferenciales para proteínas nativas y con la mutación V337M en el gen MAPT, asociada con la demencia frontotemporal. Estos resultados aportan evidencia novedosa sobre la organización molecular en sistemas de relevancia biomédica y consolidan un marco metodológico robusto e interdisciplinario para estudios cuantitativos basados en SMLM.The spatial organization of proteins within cells is a key determinant of their functionality. Super-resolution microscopy, also known as fluorescence nanoscopy, has revolutionized this field by enabling the visualization of biomolecules with nanometric precision in the cellular environment. This thesis lies within the framework of fluorescence nanoscopy, specifically single-molecule localization microscopy (SMLM), and develops experimental and analytical strategies to quantitatively characterize the nanometric organization of proteins in complex biological contexts. To this end, comprehensive acquisition, processing, and analysis routines for SMLM were established and optimized, tailored to different biological questions. This approach was applied to three distinct systems, yielding new insights into protein spatial organization in each case. First, the complex spatial architecture of mucins and trans-sialidases in Trypanosoma cruzi was characterized, revealing the existence of two populations and modes of interaction between these key proteins in the parasite’s infection mechanism. Second, the organization of βII-spectrin within the membrane-associated periodic skeleton (MPS) of neurons was analyzed, confirming in sciatic nerve tissue sections the ~190 nm periodicity between βII-spectrin segments previously observed in cultured neurons. Moreover, a new internal regularity of βII-spectrin domains within the rings was discovered. Finally, the distribution of Tau protein was investigated in human neurons, identifying distinct organizational patterns for native Tau and Tau comprising the V337M mutation in the MAPT gene, associated with frontotemporal dementia. These results provide novel evidence of the molecular organization of systems relevant to biomedicine and establish a robust, interdisciplinary methodological framework for quantitative studies based on SMLM.Fil: Escalante, Gonzalo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y NaturalesStefani, Fernando Daniel2025-12-17info:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionhttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06info:ar-repo/semantics/tesisDoctoralapplication/pdfhttps://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7874_Escalantespainfo:eu-repo/semantics/openAccesshttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/arreponame:Biblioteca Digital (UBA-FCEN)instname:Universidad Nacional de Buenos Aires. 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The spatial organization of proteins within cells is a key determinant of their functionality. Super-resolution microscopy, also known as fluorescence nanoscopy, has revolutionized this field by enabling the visualization of biomolecules with nanometric precision in the cellular environment. This thesis lies within the framework of fluorescence nanoscopy, specifically single-molecule localization microscopy (SMLM), and develops experimental and analytical strategies to quantitatively characterize the nanometric organization of proteins in complex biological contexts. To this end, comprehensive acquisition, processing, and analysis routines for SMLM were established and optimized, tailored to different biological questions. This approach was applied to three distinct systems, yielding new insights into protein spatial organization in each case. First, the complex spatial architecture of mucins and trans-sialidases in Trypanosoma cruzi was characterized, revealing the existence of two populations and modes of interaction between these key proteins in the parasite’s infection mechanism. Second, the organization of βII-spectrin within the membrane-associated periodic skeleton (MPS) of neurons was analyzed, confirming in sciatic nerve tissue sections the ~190 nm periodicity between βII-spectrin segments previously observed in cultured neurons. Moreover, a new internal regularity of βII-spectrin domains within the rings was discovered. Finally, the distribution of Tau protein was investigated in human neurons, identifying distinct organizational patterns for native Tau and Tau comprising the V337M mutation in the MAPT gene, associated with frontotemporal dementia. These results provide novel evidence of the molecular organization of systems relevant to biomedicine and establish a robust, interdisciplinary methodological framework for quantitative studies based on SMLM.
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