N-glicosilación como nexo entre biotecnología y biomedicina : producción de antígeno RBD deglicosilado en levaduras y estudio de desórdenes congénitos de glicosilación MOGS-CDG...

Autores: Idrovo Hidalgo, Tommy
Año de publicación: 2025
Idioma: español castellano
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado: versión publicada
Colaborador/a o director/a de tesis: D'Alessio, Cecilia
Descripción: La N-glicosilación es una modificación postraduccional esencial en la vía secretoria de los organismos eucariotas, determinante para el plegamiento, la estabilidad y función de muchas proteínas. Consiste en la transferencia de un glicano de composición Glc3Man9GlcNAc2 a la Asn de la secuencia Asn-X-Ser/Thr de proteínas que se están translocando al retículo endoplásmico (RE). Su estudio tiene aplicaciones tanto biomédicas como biotecnológicas, desde la comprensión de enfermedades congénitas hasta la producción de antígenos recombinantes para diagnóstico y terapias. Esta tesis aborda ambos aspectos mediante tres modelos: levaduras Schizosaccharomyces pombe y el parásito Trypanosoma cruzi como modelos celulares para estudiar enfermedades congénitas de glicosilación humanas y levaduras Pichia pastoris para producción de proteínas recombinantes virales. En el primer capítulo se abordó el estudio de enfermedades humanas congénitas de glicosilación (CDG), en particular de MOGS-CDG, debida a defectos de la glucosidasa I (GI). GI es una proteína de membrana del retículo endoplásmico (RE) y es la primera enzima que actúa en el procesamiento de N-glicanos, removiendo la Glc más externa del glicano transfeido. Mutaciones en el gen que la codifica en humanos producen defectos fenotípicos y fallas multisistémicas, siendo a día de hoy una enfermedad rara sin tratamiento específico. Para su estudio, se utilizó como modelo S. pombe carentes de GI. Las levaduras GI presentan severos defectos morfológicos y de crecimiento. Se desconoce si estos efectos son debidos a la falta de actividad catalítica o a alguna función adicional de GI. El análisis proteómico comparativo entre levaduras salvajes y GI mostró que la ausencia de GI, produce una reprogramación en un amplio espectro de procesos fisiológicos, entre los que destacan los procesos energéticos y de fisión de membranas. Demostramos que una variante soluble de GI expresada correctamente en el RE que presenta actividad in vitro e in vivo no rescata el fenotipo asociado a la deficiencia de GI. Esto sugiere que el dominio transmembrana de GI posee un rol esencial, ya sea como ancla funcional para el procesamiento rápido de N-glicanos o como componente estructural de algún complejo de la membrana del retículo endoplasmático. Por otro lado, Trypanosoma cruzi es uno de los únicos organismos eucariotas que transfiere a las proteínas los glicanos sin glucosas Man7- 9GlcNac2 durante la N-glicosilación. Sin embargo, presenta la secuencia codificante de GI en su genoma y dicho gen se transcribe, lo cual es sorprendente al no sintetizarse su sustrato. La conservación del gen y la alta homología estructural con ortólogos conocidos indican que podría existir un rol funcional específico de GI aún por descubrir. Si bien la eliminación de GI por CRISPR realizada en este trabajo no generó un fenotipo evidente en T. cruzi, estos hallazgos refuerzan la importancia de los modelos eucariotas para entender mejor los mecanismos subyacentes a los desórdenes congénitos de la glicosilación. En el segundo capítulo se exploró la expresión heteróloga del dominio de unión al receptor (RBD) del coronavirus SARS-CoV-2 en la levadura P. pastoris. Se logró producir RBD secretada al medio de cultivo con altos rendimientos y pureza, y se caracterizó su estado de glicosilación y conformación estructural. La proteína resultó correctamente plegada, funcional en la unión al receptor celular ACE2 e inmunogénica en ratones, con características similares a RBD producido en células humanas HEK-293T. Sin embargo, la preparación obtenida de P. pastoris resultó altamente heterogénea debido a variaciones en las extensiones de su manosilación. Para obtener una preparación homogénea se desarrollaron protocolos para deglicosilar y purificar simultáneamente proteína obtenida del sobrenadante de cultivo de P. pastoris. La proteína deglicosilada (yRBD-C101) conservó su estructura secundaria y terciaria, permaneció monomérica y mostró estabilidad termodinámica. Además, yRBD-C101 produjo una respuesta humoral 10 veces mayor que la proteína glicosilada, y distinguió eficazmente anticuerpos de sueros negativos de aquellos de pacientes convalecientes de COVID-19, confirmando su utilidad como antígeno para ensayos serológicos. Estos resultados destacan a P. pastoris como un sistema de bajo costo, escalable y seguro para producir proteínas recombinantes de mamíferos para ser usadas como antígeno vacunal y en diagnóstico en aquellos casos en los que los glicanos son requeridos únicamente para su correcto plegamiento, pero no para su función de reconocimiento posterior. En conjunto, la tesis integra investigación básica y aplicada sobre N-glicosilación, demostrando cómo sistemas eucariotas pueden ser aprovechados tanto para la producción recombinante de proteínas funcionales como para desentrañar roles estructurales y regulatorios de enzimas críticas en la fisiología celular. Así, se establece un puente entre biotecnología y biomedicina, mostrando la relevancia de la N-glicosilación en distintos contextos y su potencial traslacional. Los resultados de esta tesis se publicaron parcialmente en: Argentinian AntiCovid Consortium. Structural and functional comparison of SARS-CoV- 2-spike receptor binding domain produced in Pichia pastoris and mammalian cells. Sci Rep 10, 21779 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-78711-6. Argentinian AntiCovid Consortium. Covalent coupling of Spike’s receptor binding domain to a multimeric carrier produces a high immune response against SARS-CoV- 2. Sci Rep 12, 692 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-021-03675-0. Noseda et al. Development of a cost-effective process for the heterologous production of SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain using Pichia pastoris in stirred-tank bioreactor. Fermentation 9, 497 (2023). https://doi.org/10.3390/fermentation9060497. Idrovo-Hidalgo et al. Deglycosylated RBD produced in Pichia pastoris as a low-cost sera COVID-19 diagnosis tool and a vaccine candidate. Glycobiology 34, cwad089 (2024). https://doi.org/10.1093/glycob/cwad089. Numerosas presentaciones a congresos nacionales e internacionales.
N-glycosylation is an essential post-translational modification in the secretory pathway of eukaryotic organisms, crucial for the folding, stability, and function of many proteins. It consists of the transfer of a glycan of composition Glc3Man9GlcNAc2 to the Asn residue of the Asn-X-Ser/Thr sequence of proteins being translocated into the endoplasmic reticulum (ER). Its study has both biomedical and biotechnological applications, ranging from the understanding of congenital diseases to the production of recombinant antigens for diagnosis and therapy. This thesis addresses both aspects through three models: Schizosaccharomyces pombe yeast and the parasite Trypanosoma cruzi as cellular models to study human congenital disorders of glycosylation, and Pichia pastoris yeast for the production of viral recombinant proteins. In the first chapter, the study focused on human congenital disorders of glycosylation (CDG), particularly MOGS-CDG, caused by defects in glucosidase I (GI). GI is an endoplasmic reticulum (ER) membrane protein and the first enzyme involved in N-glycan processing, removing the outermost Glc residue from the transferred glycan. Mutations in the human gene encoding this enzyme cause phenotypic defects and multisystemic failures, representing to date a rare disease without specific treatment. For its study, S. pombe strains lacking GI were used as a model. ΔGI yeasts show severe morphological and growth defects. It remains unclear whether these effects are due to the lack of catalytic activity or to an additional function of GI. The comparative proteomic analysis between wild-type yeasts and ΔGI showed that the absence of GI produces a reprogramming in a wide spectrum of physiological processes, among which energy-related processes and membrane fission stand out. We demonstrate that a soluble variant of GI, correctly expressed in the ER and showing in vitro and in vivo activity, does not rescue the phenotype associated with GI deficiency. This suggests that the transmembrane domain of GI plays an essential role, either as a functional anchor for rapid N-glycan processing or as a structural component of an ER membrane complex. On the other hand, Trypanosoma cruzi is one of the few eukaryotic organisms that transfers to proteins glucose-free glycans (Man7–9GlcNAc2) during N-glycosylation. However, it contains the coding sequence of GI in its genome, and this gene is transcribed, which is surprising since its substrate is not synthesized. The conservation of the gene and the high structural homology with known orthologs suggest that a specific functional role of GI may still exist. Although the CRISPR-mediated elimination of GI performed in this work did not generate an evident phenotype in T. cruzi, these findings reinforce the importance of eukaryotic models to better understand the mechanisms underlying congenital disorders of glycosylation. In the second chapter, the heterologous expression of the receptor-binding domain (RBD) of the SARS-CoV-2 coronavirus Spike protein was explored in P. pastoris yeast. Secreted RBD was successfully produced in the culture medium with high yield and purity, and its glycosylation status and structural conformation were characterized. The protein was properly folded, functional in binding to the cellular receptor ACE2, and immunogenic in mice, showing characteristics similar to RBD produced in human HEK-293T cells. However, the preparation obtained from P. pastoris was highly heterogeneous due to variations in mannosylation extent. To obtain a homogeneous preparation, protocols were developed to deglycosylate and simultaneously purify the protein obtained from the P. pastoris culture supernatant. The deglycosylated protein (yRBD-C101) retained its secondary and tertiary structure, remained monomeric, and showed thermodynamic stability. Moreover, yRBD-C101 elicited a humoral response ten times higher than the glycosylated protein and efficiently distinguished antibodies from negative sera and convalescent COVID-19 patients, confirming its usefulness as an antigen for serological assays. These results highlight P. pastoris as a low-cost, scalable, and safe system for producing recombinant mammalian proteins to be used as vaccine antigens and in diagnostics, in cases where glycans are required only for proper folding but not for subsequent recognition function. Altogether, this thesis integrates basic and applied research on N-glycosylation, demonstrating how eukaryotic systems can be exploited both for the recombinant production of functional proteins and for elucidating structural and regulatory roles of critical enzymes in cellular physiology. Thus, it establishes a bridge between biotechnology and biomedicine, showing the relevance of N-glycosylation in different contexts and its translational potential. The results of this thesis were partially published in: Argentinian AntiCovid Consortium. Structural and functional comparison of SARS-CoV-2-spike receptor binding domain produced in Pichia pastoris and mammalian cells. Sci Rep 10, 21779 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-78711-6. Argentinian AntiCovid Consortium. Covalent coupling of Spike’s receptor binding domain to a multimeric carrier produces a high immune response against SARS-CoV-2. Sci Rep 12, 692 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-021- 03675-0. Noseda et al. Development of a cost-effective process for the heterologous production of SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain using Pichia pastoris in stirred-tank bioreactor. Fermentation 9, 497 (2023). https://doi.org/10.3390/fermentation9060497. Idrovo-Hidalgo et al. Deglycosylated RBD produced in Pichia pastoris as a low-cost sera COVID-19 diagnosis tool and a vaccine candidate. Glycobiology 34, cwad089 (2024). https://doi.org/10.1093/glycob/cwad089. Numerosas presentaciones a congresos nacionales e internacionales.
Fil: Idrovo Hidalgo, Tommy. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.
Materia: GLUCOSIDASA I
LEVADURA
MOGS-CDG
N-GLICOSILACION
PICHIA PASTORIS
RBD
SARS-COV-2
SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE
TRYPANOSOMA CRUZI
VIA SECRETORIA
GLUCOSIDASE I
YEAST
MOGS-CDG
N-GLYCOSYLATION
PICHIA PASTORIS
RBD
SARS-COV-2
SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE
TRYPANOSOMA CRUZI
SECRETORY PATHWAY
Nivel de accesibilidad: acceso abierto
Condiciones de uso: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar
Repositorio
Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
OAI Identificador: tesis:tesis_n7883_IdrovoHidalgo

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Consiste en la transferencia de un glicano de composición Glc3Man9GlcNAc2 a la Asn de la secuencia Asn-X-Ser/Thr de proteínas que se están translocando al retículo endoplásmico (RE). Su estudio tiene aplicaciones tanto biomédicas como biotecnológicas, desde la comprensión de enfermedades congénitas hasta la producción de antígenos recombinantes para diagnóstico y terapias. Esta tesis aborda ambos aspectos mediante tres modelos: levaduras Schizosaccharomyces pombe y el parásito Trypanosoma cruzi como modelos celulares para estudiar enfermedades congénitas de glicosilación humanas y levaduras Pichia pastoris para producción de proteínas recombinantes virales. En el primer capítulo se abordó el estudio de enfermedades humanas congénitas de glicosilación (CDG), en particular de MOGS-CDG, debida a defectos de la glucosidasa I (GI). GI es una proteína de membrana del retículo endoplásmico (RE) y es la primera enzima que actúa en el procesamiento de N-glicanos, removiendo la Glc más externa del glicano transfeido. Mutaciones en el gen que la codifica en humanos producen defectos fenotípicos y fallas multisistémicas, siendo a día de hoy una enfermedad rara sin tratamiento específico. Para su estudio, se utilizó como modelo S. pombe carentes de GI. Las levaduras GI presentan severos defectos morfológicos y de crecimiento. Se desconoce si estos efectos son debidos a la falta de actividad catalítica o a alguna función adicional de GI. El análisis proteómico comparativo entre levaduras salvajes y GI mostró que la ausencia de GI, produce una reprogramación en un amplio espectro de procesos fisiológicos, entre los que destacan los procesos energéticos y de fisión de membranas. Demostramos que una variante soluble de GI expresada correctamente en el RE que presenta actividad in vitro e in vivo no rescata el fenotipo asociado a la deficiencia de GI. Esto sugiere que el dominio transmembrana de GI posee un rol esencial, ya sea como ancla funcional para el procesamiento rápido de N-glicanos o como componente estructural de algún complejo de la membrana del retículo endoplasmático. Por otro lado, Trypanosoma cruzi es uno de los únicos organismos eucariotas que transfiere a las proteínas los glicanos sin glucosas Man7- 9GlcNac2 durante la N-glicosilación. Sin embargo, presenta la secuencia codificante de GI en su genoma y dicho gen se transcribe, lo cual es sorprendente al no sintetizarse su sustrato. La conservación del gen y la alta homología estructural con ortólogos conocidos indican que podría existir un rol funcional específico de GI aún por descubrir. Si bien la eliminación de GI por CRISPR realizada en este trabajo no generó un fenotipo evidente en T. cruzi, estos hallazgos refuerzan la importancia de los modelos eucariotas para entender mejor los mecanismos subyacentes a los desórdenes congénitos de la glicosilación. En el segundo capítulo se exploró la expresión heteróloga del dominio de unión al receptor (RBD) del coronavirus SARS-CoV-2 en la levadura P. pastoris. Se logró producir RBD secretada al medio de cultivo con altos rendimientos y pureza, y se caracterizó su estado de glicosilación y conformación estructural. La proteína resultó correctamente plegada, funcional en la unión al receptor celular ACE2 e inmunogénica en ratones, con características similares a RBD producido en células humanas HEK-293T. Sin embargo, la preparación obtenida de P. pastoris resultó altamente heterogénea debido a variaciones en las extensiones de su manosilación. Para obtener una preparación homogénea se desarrollaron protocolos para deglicosilar y purificar simultáneamente proteína obtenida del sobrenadante de cultivo de P. pastoris. La proteína deglicosilada (yRBD-C101) conservó su estructura secundaria y terciaria, permaneció monomérica y mostró estabilidad termodinámica. Además, yRBD-C101 produjo una respuesta humoral 10 veces mayor que la proteína glicosilada, y distinguió eficazmente anticuerpos de sueros negativos de aquellos de pacientes convalecientes de COVID-19, confirmando su utilidad como antígeno para ensayos serológicos. Estos resultados destacan a P. pastoris como un sistema de bajo costo, escalable y seguro para producir proteínas recombinantes de mamíferos para ser usadas como antígeno vacunal y en diagnóstico en aquellos casos en los que los glicanos son requeridos únicamente para su correcto plegamiento, pero no para su función de reconocimiento posterior. En conjunto, la tesis integra investigación básica y aplicada sobre N-glicosilación, demostrando cómo sistemas eucariotas pueden ser aprovechados tanto para la producción recombinante de proteínas funcionales como para desentrañar roles estructurales y regulatorios de enzimas críticas en la fisiología celular. Así, se establece un puente entre biotecnología y biomedicina, mostrando la relevancia de la N-glicosilación en distintos contextos y su potencial traslacional. Los resultados de esta tesis se publicaron parcialmente en: Argentinian AntiCovid Consortium. Structural and functional comparison of SARS-CoV- 2-spike receptor binding domain produced in Pichia pastoris and mammalian cells. Sci Rep 10, 21779 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-78711-6. Argentinian AntiCovid Consortium. Covalent coupling of Spike’s receptor binding domain to a multimeric carrier produces a high immune response against SARS-CoV- 2. Sci Rep 12, 692 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-021-03675-0. Noseda et al. Development of a cost-effective process for the heterologous production of SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain using Pichia pastoris in stirred-tank bioreactor. Fermentation 9, 497 (2023). https://doi.org/10.3390/fermentation9060497. Idrovo-Hidalgo et al. Deglycosylated RBD produced in Pichia pastoris as a low-cost sera COVID-19 diagnosis tool and a vaccine candidate. Glycobiology 34, cwad089 (2024). https://doi.org/10.1093/glycob/cwad089. Numerosas presentaciones a congresos nacionales e internacionales.N-glycosylation is an essential post-translational modification in the secretory pathway of eukaryotic organisms, crucial for the folding, stability, and function of many proteins. It consists of the transfer of a glycan of composition Glc3Man9GlcNAc2 to the Asn residue of the Asn-X-Ser/Thr sequence of proteins being translocated into the endoplasmic reticulum (ER). Its study has both biomedical and biotechnological applications, ranging from the understanding of congenital diseases to the production of recombinant antigens for diagnosis and therapy. This thesis addresses both aspects through three models: Schizosaccharomyces pombe yeast and the parasite Trypanosoma cruzi as cellular models to study human congenital disorders of glycosylation, and Pichia pastoris yeast for the production of viral recombinant proteins. In the first chapter, the study focused on human congenital disorders of glycosylation (CDG), particularly MOGS-CDG, caused by defects in glucosidase I (GI). GI is an endoplasmic reticulum (ER) membrane protein and the first enzyme involved in N-glycan processing, removing the outermost Glc residue from the transferred glycan. Mutations in the human gene encoding this enzyme cause phenotypic defects and multisystemic failures, representing to date a rare disease without specific treatment. For its study, S. pombe strains lacking GI were used as a model. ΔGI yeasts show severe morphological and growth defects. It remains unclear whether these effects are due to the lack of catalytic activity or to an additional function of GI. The comparative proteomic analysis between wild-type yeasts and ΔGI showed that the absence of GI produces a reprogramming in a wide spectrum of physiological processes, among which energy-related processes and membrane fission stand out. We demonstrate that a soluble variant of GI, correctly expressed in the ER and showing in vitro and in vivo activity, does not rescue the phenotype associated with GI deficiency. This suggests that the transmembrane domain of GI plays an essential role, either as a functional anchor for rapid N-glycan processing or as a structural component of an ER membrane complex. On the other hand, Trypanosoma cruzi is one of the few eukaryotic organisms that transfers to proteins glucose-free glycans (Man7–9GlcNAc2) during N-glycosylation. However, it contains the coding sequence of GI in its genome, and this gene is transcribed, which is surprising since its substrate is not synthesized. The conservation of the gene and the high structural homology with known orthologs suggest that a specific functional role of GI may still exist. Although the CRISPR-mediated elimination of GI performed in this work did not generate an evident phenotype in T. cruzi, these findings reinforce the importance of eukaryotic models to better understand the mechanisms underlying congenital disorders of glycosylation. In the second chapter, the heterologous expression of the receptor-binding domain (RBD) of the SARS-CoV-2 coronavirus Spike protein was explored in P. pastoris yeast. Secreted RBD was successfully produced in the culture medium with high yield and purity, and its glycosylation status and structural conformation were characterized. The protein was properly folded, functional in binding to the cellular receptor ACE2, and immunogenic in mice, showing characteristics similar to RBD produced in human HEK-293T cells. However, the preparation obtained from P. pastoris was highly heterogeneous due to variations in mannosylation extent. To obtain a homogeneous preparation, protocols were developed to deglycosylate and simultaneously purify the protein obtained from the P. pastoris culture supernatant. The deglycosylated protein (yRBD-C101) retained its secondary and tertiary structure, remained monomeric, and showed thermodynamic stability. Moreover, yRBD-C101 elicited a humoral response ten times higher than the glycosylated protein and efficiently distinguished antibodies from negative sera and convalescent COVID-19 patients, confirming its usefulness as an antigen for serological assays. These results highlight P. pastoris as a low-cost, scalable, and safe system for producing recombinant mammalian proteins to be used as vaccine antigens and in diagnostics, in cases where glycans are required only for proper folding but not for subsequent recognition function. Altogether, this thesis integrates basic and applied research on N-glycosylation, demonstrating how eukaryotic systems can be exploited both for the recombinant production of functional proteins and for elucidating structural and regulatory roles of critical enzymes in cellular physiology. Thus, it establishes a bridge between biotechnology and biomedicine, showing the relevance of N-glycosylation in different contexts and its translational potential. The results of this thesis were partially published in: Argentinian AntiCovid Consortium. Structural and functional comparison of SARS-CoV-2-spike receptor binding domain produced in Pichia pastoris and mammalian cells. Sci Rep 10, 21779 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-78711-6. Argentinian AntiCovid Consortium. Covalent coupling of Spike’s receptor binding domain to a multimeric carrier produces a high immune response against SARS-CoV-2. Sci Rep 12, 692 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-021- 03675-0. Noseda et al. Development of a cost-effective process for the heterologous production of SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain using Pichia pastoris in stirred-tank bioreactor. Fermentation 9, 497 (2023). https://doi.org/10.3390/fermentation9060497. Idrovo-Hidalgo et al. Deglycosylated RBD produced in Pichia pastoris as a low-cost sera COVID-19 diagnosis tool and a vaccine candidate. Glycobiology 34, cwad089 (2024). https://doi.org/10.1093/glycob/cwad089. 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En el primer capítulo se abordó el estudio de enfermedades humanas congénitas de glicosilación (CDG), en particular de MOGS-CDG, debida a defectos de la glucosidasa I (GI). GI es una proteína de membrana del retículo endoplásmico (RE) y es la primera enzima que actúa en el procesamiento de N-glicanos, removiendo la Glc más externa del glicano transfeido. Mutaciones en el gen que la codifica en humanos producen defectos fenotípicos y fallas multisistémicas, siendo a día de hoy una enfermedad rara sin tratamiento específico. Para su estudio, se utilizó como modelo S. pombe carentes de GI. Las levaduras GI presentan severos defectos morfológicos y de crecimiento. Se desconoce si estos efectos son debidos a la falta de actividad catalítica o a alguna función adicional de GI. El análisis proteómico comparativo entre levaduras salvajes y GI mostró que la ausencia de GI, produce una reprogramación en un amplio espectro de procesos fisiológicos, entre los que destacan los procesos energéticos y de fisión de membranas. Demostramos que una variante soluble de GI expresada correctamente en el RE que presenta actividad in vitro e in vivo no rescata el fenotipo asociado a la deficiencia de GI. Esto sugiere que el dominio transmembrana de GI posee un rol esencial, ya sea como ancla funcional para el procesamiento rápido de N-glicanos o como componente estructural de algún complejo de la membrana del retículo endoplasmático. Por otro lado, Trypanosoma cruzi es uno de los únicos organismos eucariotas que transfiere a las proteínas los glicanos sin glucosas Man7- 9GlcNac2 durante la N-glicosilación. Sin embargo, presenta la secuencia codificante de GI en su genoma y dicho gen se transcribe, lo cual es sorprendente al no sintetizarse su sustrato. La conservación del gen y la alta homología estructural con ortólogos conocidos indican que podría existir un rol funcional específico de GI aún por descubrir. Si bien la eliminación de GI por CRISPR realizada en este trabajo no generó un fenotipo evidente en T. cruzi, estos hallazgos refuerzan la importancia de los modelos eucariotas para entender mejor los mecanismos subyacentes a los desórdenes congénitos de la glicosilación. En el segundo capítulo se exploró la expresión heteróloga del dominio de unión al receptor (RBD) del coronavirus SARS-CoV-2 en la levadura P. pastoris. Se logró producir RBD secretada al medio de cultivo con altos rendimientos y pureza, y se caracterizó su estado de glicosilación y conformación estructural. La proteína resultó correctamente plegada, funcional en la unión al receptor celular ACE2 e inmunogénica en ratones, con características similares a RBD producido en células humanas HEK-293T. Sin embargo, la preparación obtenida de P. pastoris resultó altamente heterogénea debido a variaciones en las extensiones de su manosilación. Para obtener una preparación homogénea se desarrollaron protocolos para deglicosilar y purificar simultáneamente proteína obtenida del sobrenadante de cultivo de P. pastoris. La proteína deglicosilada (yRBD-C101) conservó su estructura secundaria y terciaria, permaneció monomérica y mostró estabilidad termodinámica. Además, yRBD-C101 produjo una respuesta humoral 10 veces mayor que la proteína glicosilada, y distinguió eficazmente anticuerpos de sueros negativos de aquellos de pacientes convalecientes de COVID-19, confirmando su utilidad como antígeno para ensayos serológicos. Estos resultados destacan a P. pastoris como un sistema de bajo costo, escalable y seguro para producir proteínas recombinantes de mamíferos para ser usadas como antígeno vacunal y en diagnóstico en aquellos casos en los que los glicanos son requeridos únicamente para su correcto plegamiento, pero no para su función de reconocimiento posterior. En conjunto, la tesis integra investigación básica y aplicada sobre N-glicosilación, demostrando cómo sistemas eucariotas pueden ser aprovechados tanto para la producción recombinante de proteínas funcionales como para desentrañar roles estructurales y regulatorios de enzimas críticas en la fisiología celular. Así, se establece un puente entre biotecnología y biomedicina, mostrando la relevancia de la N-glicosilación en distintos contextos y su potencial traslacional. Los resultados de esta tesis se publicaron parcialmente en: Argentinian AntiCovid Consortium. Structural and functional comparison of SARS-CoV- 2-spike receptor binding domain produced in Pichia pastoris and mammalian cells. Sci Rep 10, 21779 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-78711-6. Argentinian AntiCovid Consortium. Covalent coupling of Spike’s receptor binding domain to a multimeric carrier produces a high immune response against SARS-CoV- 2. Sci Rep 12, 692 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-021-03675-0. Noseda et al. Development of a cost-effective process for the heterologous production of SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain using Pichia pastoris in stirred-tank bioreactor. Fermentation 9, 497 (2023). https://doi.org/10.3390/fermentation9060497. Idrovo-Hidalgo et al. Deglycosylated RBD produced in Pichia pastoris as a low-cost sera COVID-19 diagnosis tool and a vaccine candidate. Glycobiology 34, cwad089 (2024). https://doi.org/10.1093/glycob/cwad089. Numerosas presentaciones a congresos nacionales e internacionales. N-glycosylation is an essential post-translational modification in the secretory pathway of eukaryotic organisms, crucial for the folding, stability, and function of many proteins. It consists of the transfer of a glycan of composition Glc3Man9GlcNAc2 to the Asn residue of the Asn-X-Ser/Thr sequence of proteins being translocated into the endoplasmic reticulum (ER). Its study has both biomedical and biotechnological applications, ranging from the understanding of congenital diseases to the production of recombinant antigens for diagnosis and therapy. This thesis addresses both aspects through three models: Schizosaccharomyces pombe yeast and the parasite Trypanosoma cruzi as cellular models to study human congenital disorders of glycosylation, and Pichia pastoris yeast for the production of viral recombinant proteins. In the first chapter, the study focused on human congenital disorders of glycosylation (CDG), particularly MOGS-CDG, caused by defects in glucosidase I (GI). GI is an endoplasmic reticulum (ER) membrane protein and the first enzyme involved in N-glycan processing, removing the outermost Glc residue from the transferred glycan. Mutations in the human gene encoding this enzyme cause phenotypic defects and multisystemic failures, representing to date a rare disease without specific treatment. For its study, S. pombe strains lacking GI were used as a model. ΔGI yeasts show severe morphological and growth defects. It remains unclear whether these effects are due to the lack of catalytic activity or to an additional function of GI. The comparative proteomic analysis between wild-type yeasts and ΔGI showed that the absence of GI produces a reprogramming in a wide spectrum of physiological processes, among which energy-related processes and membrane fission stand out. We demonstrate that a soluble variant of GI, correctly expressed in the ER and showing in vitro and in vivo activity, does not rescue the phenotype associated with GI deficiency. This suggests that the transmembrane domain of GI plays an essential role, either as a functional anchor for rapid N-glycan processing or as a structural component of an ER membrane complex. On the other hand, Trypanosoma cruzi is one of the few eukaryotic organisms that transfers to proteins glucose-free glycans (Man7–9GlcNAc2) during N-glycosylation. However, it contains the coding sequence of GI in its genome, and this gene is transcribed, which is surprising since its substrate is not synthesized. The conservation of the gene and the high structural homology with known orthologs suggest that a specific functional role of GI may still exist. Although the CRISPR-mediated elimination of GI performed in this work did not generate an evident phenotype in T. cruzi, these findings reinforce the importance of eukaryotic models to better understand the mechanisms underlying congenital disorders of glycosylation. In the second chapter, the heterologous expression of the receptor-binding domain (RBD) of the SARS-CoV-2 coronavirus Spike protein was explored in P. pastoris yeast. Secreted RBD was successfully produced in the culture medium with high yield and purity, and its glycosylation status and structural conformation were characterized. The protein was properly folded, functional in binding to the cellular receptor ACE2, and immunogenic in mice, showing characteristics similar to RBD produced in human HEK-293T cells. However, the preparation obtained from P. pastoris was highly heterogeneous due to variations in mannosylation extent. To obtain a homogeneous preparation, protocols were developed to deglycosylate and simultaneously purify the protein obtained from the P. pastoris culture supernatant. The deglycosylated protein (yRBD-C101) retained its secondary and tertiary structure, remained monomeric, and showed thermodynamic stability. Moreover, yRBD-C101 elicited a humoral response ten times higher than the glycosylated protein and efficiently distinguished antibodies from negative sera and convalescent COVID-19 patients, confirming its usefulness as an antigen for serological assays. These results highlight P. pastoris as a low-cost, scalable, and safe system for producing recombinant mammalian proteins to be used as vaccine antigens and in diagnostics, in cases where glycans are required only for proper folding but not for subsequent recognition function. Altogether, this thesis integrates basic and applied research on N-glycosylation, demonstrating how eukaryotic systems can be exploited both for the recombinant production of functional proteins and for elucidating structural and regulatory roles of critical enzymes in cellular physiology. Thus, it establishes a bridge between biotechnology and biomedicine, showing the relevance of N-glycosylation in different contexts and its translational potential. The results of this thesis were partially published in: Argentinian AntiCovid Consortium. Structural and functional comparison of SARS-CoV-2-spike receptor binding domain produced in Pichia pastoris and mammalian cells. Sci Rep 10, 21779 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-78711-6. Argentinian AntiCovid Consortium. Covalent coupling of Spike’s receptor binding domain to a multimeric carrier produces a high immune response against SARS-CoV-2. Sci Rep 12, 692 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-021- 03675-0. Noseda et al. Development of a cost-effective process for the heterologous production of SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain using Pichia pastoris in stirred-tank bioreactor. Fermentation 9, 497 (2023). https://doi.org/10.3390/fermentation9060497. Idrovo-Hidalgo et al. Deglycosylated RBD produced in Pichia pastoris as a low-cost sera COVID-19 diagnosis tool and a vaccine candidate. Glycobiology 34, cwad089 (2024). https://doi.org/10.1093/glycob/cwad089. Numerosas presentaciones a congresos nacionales e internacionales. Fil: Idrovo Hidalgo, Tommy. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.
description	La N-glicosilación es una modificación postraduccional esencial en la vía secretoria de los organismos eucariotas, determinante para el plegamiento, la estabilidad y función de muchas proteínas. Consiste en la transferencia de un glicano de composición Glc3Man9GlcNAc2 a la Asn de la secuencia Asn-X-Ser/Thr de proteínas que se están translocando al retículo endoplásmico (RE). Su estudio tiene aplicaciones tanto biomédicas como biotecnológicas, desde la comprensión de enfermedades congénitas hasta la producción de antígenos recombinantes para diagnóstico y terapias. Esta tesis aborda ambos aspectos mediante tres modelos: levaduras Schizosaccharomyces pombe y el parásito Trypanosoma cruzi como modelos celulares para estudiar enfermedades congénitas de glicosilación humanas y levaduras Pichia pastoris para producción de proteínas recombinantes virales. En el primer capítulo se abordó el estudio de enfermedades humanas congénitas de glicosilación (CDG), en particular de MOGS-CDG, debida a defectos de la glucosidasa I (GI). GI es una proteína de membrana del retículo endoplásmico (RE) y es la primera enzima que actúa en el procesamiento de N-glicanos, removiendo la Glc más externa del glicano transfeido. Mutaciones en el gen que la codifica en humanos producen defectos fenotípicos y fallas multisistémicas, siendo a día de hoy una enfermedad rara sin tratamiento específico. Para su estudio, se utilizó como modelo S. pombe carentes de GI. Las levaduras GI presentan severos defectos morfológicos y de crecimiento. Se desconoce si estos efectos son debidos a la falta de actividad catalítica o a alguna función adicional de GI. El análisis proteómico comparativo entre levaduras salvajes y GI mostró que la ausencia de GI, produce una reprogramación en un amplio espectro de procesos fisiológicos, entre los que destacan los procesos energéticos y de fisión de membranas. Demostramos que una variante soluble de GI expresada correctamente en el RE que presenta actividad in vitro e in vivo no rescata el fenotipo asociado a la deficiencia de GI. Esto sugiere que el dominio transmembrana de GI posee un rol esencial, ya sea como ancla funcional para el procesamiento rápido de N-glicanos o como componente estructural de algún complejo de la membrana del retículo endoplasmático. Por otro lado, Trypanosoma cruzi es uno de los únicos organismos eucariotas que transfiere a las proteínas los glicanos sin glucosas Man7- 9GlcNac2 durante la N-glicosilación. Sin embargo, presenta la secuencia codificante de GI en su genoma y dicho gen se transcribe, lo cual es sorprendente al no sintetizarse su sustrato. La conservación del gen y la alta homología estructural con ortólogos conocidos indican que podría existir un rol funcional específico de GI aún por descubrir. Si bien la eliminación de GI por CRISPR realizada en este trabajo no generó un fenotipo evidente en T. cruzi, estos hallazgos refuerzan la importancia de los modelos eucariotas para entender mejor los mecanismos subyacentes a los desórdenes congénitos de la glicosilación. En el segundo capítulo se exploró la expresión heteróloga del dominio de unión al receptor (RBD) del coronavirus SARS-CoV-2 en la levadura P. pastoris. Se logró producir RBD secretada al medio de cultivo con altos rendimientos y pureza, y se caracterizó su estado de glicosilación y conformación estructural. La proteína resultó correctamente plegada, funcional en la unión al receptor celular ACE2 e inmunogénica en ratones, con características similares a RBD producido en células humanas HEK-293T. Sin embargo, la preparación obtenida de P. pastoris resultó altamente heterogénea debido a variaciones en las extensiones de su manosilación. Para obtener una preparación homogénea se desarrollaron protocolos para deglicosilar y purificar simultáneamente proteína obtenida del sobrenadante de cultivo de P. pastoris. La proteína deglicosilada (yRBD-C101) conservó su estructura secundaria y terciaria, permaneció monomérica y mostró estabilidad termodinámica. Además, yRBD-C101 produjo una respuesta humoral 10 veces mayor que la proteína glicosilada, y distinguió eficazmente anticuerpos de sueros negativos de aquellos de pacientes convalecientes de COVID-19, confirmando su utilidad como antígeno para ensayos serológicos. Estos resultados destacan a P. pastoris como un sistema de bajo costo, escalable y seguro para producir proteínas recombinantes de mamíferos para ser usadas como antígeno vacunal y en diagnóstico en aquellos casos en los que los glicanos son requeridos únicamente para su correcto plegamiento, pero no para su función de reconocimiento posterior. En conjunto, la tesis integra investigación básica y aplicada sobre N-glicosilación, demostrando cómo sistemas eucariotas pueden ser aprovechados tanto para la producción recombinante de proteínas funcionales como para desentrañar roles estructurales y regulatorios de enzimas críticas en la fisiología celular. Así, se establece un puente entre biotecnología y biomedicina, mostrando la relevancia de la N-glicosilación en distintos contextos y su potencial traslacional. Los resultados de esta tesis se publicaron parcialmente en: Argentinian AntiCovid Consortium. Structural and functional comparison of SARS-CoV- 2-spike receptor binding domain produced in Pichia pastoris and mammalian cells. Sci Rep 10, 21779 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-78711-6. Argentinian AntiCovid Consortium. Covalent coupling of Spike’s receptor binding domain to a multimeric carrier produces a high immune response against SARS-CoV- 2. Sci Rep 12, 692 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-021-03675-0. Noseda et al. Development of a cost-effective process for the heterologous production of SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain using Pichia pastoris in stirred-tank bioreactor. Fermentation 9, 497 (2023). https://doi.org/10.3390/fermentation9060497. Idrovo-Hidalgo et al. Deglycosylated RBD produced in Pichia pastoris as a low-cost sera COVID-19 diagnosis tool and a vaccine candidate. Glycobiology 34, cwad089 (2024). https://doi.org/10.1093/glycob/cwad089. Numerosas presentaciones a congresos nacionales e internacionales.
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N-glicosilación como nexo entre biotecnología y biomedicina : producción de antígeno RBD deglicosilado en levaduras y estudio de desórdenes congénitos de glicosilación MOGS-CDG...

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