Identification of the palmitoyltransferase DHHC4 interactome using proximity-dependent biotinylation by BioID2

Autores
Meinero, Rocio del Milagro; Valdez Taubas, Javier
Año de publicación
2022
Idioma
inglés
Tipo de recurso
documento de conferencia
Estado
versión publicada
Descripción
Fil: Meinero, Rocío del Milagro. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Fil: Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba (CIQUIBIC); Argentina.
Fil: Valdez Taubas, Javier. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.
Fil: Valdez Taubas, Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina..
La identificación de asociaciones proteína-proteína es un enfoque fundamental para el estudio de la función proteica y los mecanismos biológicos. BioID (identificación de biotina dependiente de proximidad) es una herramienta novedosa y potente para estudiar las interacciones proteína-proteína in vivo. Este sistema se basa en la fusión de una proteína cebo de interés con una enzima biotina ligasa mutante promiscua capaz de biotinilar los grupos amino de las proteínas vecinas sobre biotina. Posteriormente, las proteínas biotiniladas pueden aislarse selectivamente mediante métodos convencionales de captura de biotina e identificarse mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Una de las mayores ventajas de BioID2 es que no se limita a los ligandos directos, ya que puede detectar interacciones débiles y transitorias entre proteínas a lo largo del tiempo. Además, este enfoque no requiere reactivos tóxicos y es sencillo de usar. La S-acilación es una modificación postraduccional común de las proteínas celulares que implica la unión de ácidos grasos a un residuo de cisteína. Esta modificación es reversible y regula procesos de gran importancia biológica; muchas enfermedades están relacionadas con alteraciones en la S-acilación. Una familia de enzimas llamadas palmitoiltransferasas (PAT) cataliza esta modificación. Existen 23 miembros de esta familia (DHHC1-23) en el genoma humano y la información sobre ellos aún es limitada y sigue creciendo. Aquí, centramos nuestra investigación en DHHC4, una PAT poco caracterizada. El presente estudio exploró el interactoma de DHHC4 en busca de nuevas proteínas interactuantes, utilizando BioID2 en células humanas HeLa cultivadas. Electroporamos células HeLa con DHHC4-BioID2-HA o BioID2-HA como control. Las diferencias en la biotinilación de proteínas entre los tratamientos se confirmaron mediante inmunoblotting en células HeLa. A continuación, confirmamos la presencia de los constructos en el retículo endoplasmático mediante microscopía de inmunofluorescencia indirecta. En el experimento de LC-MS, nuestros resultados preliminares detectaron x proteínas interactuantes que podrían representar nuevos reguladores o dianas potenciales de DHHC4. En un intento por identificar posibles sustratos en la lista de proteínas interactuantes encontradas, hemos buscado sitios de palmitoilación predichos en todas las proteínas identificadas mediante el software SwissPalm. Actualmente estamos confirmando estos resultados aumentando las réplicas y validando el estado de palmitoilación de algunas de estas proteínas. De esta manera, podrían haberse identificado nuevos reguladores o dianas de DHHC4, lo que contribuiría a futuras investigaciones sobre la palmitoilación.
Fil: Meinero, Rocío del Milagro. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Fil: Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba (CIQUIBIC); Argentina.
Fil: Valdez Taubas, Javier. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.
Fil: Valdez Taubas, Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina..
Biología Celular, Microbiología
Materia
Biotina
Enzimas
Nivel de accesibilidad
acceso abierto
Condiciones de uso
Repositorio
Repositorio Digital Universitario (UNC)
Institución
Universidad Nacional de Córdoba
OAI Identificador
oai:rdu.unc.edu.ar:11086/561514
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BioID (identificación de biotina dependiente de proximidad) es una herramienta novedosa y potente para estudiar las interacciones proteína-proteína in vivo. Este sistema se basa en la fusión de una proteína cebo de interés con una enzima biotina ligasa mutante promiscua capaz de biotinilar los grupos amino de las proteínas vecinas sobre biotina. Posteriormente, las proteínas biotiniladas pueden aislarse selectivamente mediante métodos convencionales de captura de biotina e identificarse mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Una de las mayores ventajas de BioID2 es que no se limita a los ligandos directos, ya que puede detectar interacciones débiles y transitorias entre proteínas a lo largo del tiempo. Además, este enfoque no requiere reactivos tóxicos y es sencillo de usar. La S-acilación es una modificación postraduccional común de las proteínas celulares que implica la unión de ácidos grasos a un residuo de cisteína. Esta modificación es reversible y regula procesos de gran importancia biológica; muchas enfermedades están relacionadas con alteraciones en la S-acilación. Una familia de enzimas llamadas palmitoiltransferasas (PAT) cataliza esta modificación. Existen 23 miembros de esta familia (DHHC1-23) en el genoma humano y la información sobre ellos aún es limitada y sigue creciendo. Aquí, centramos nuestra investigación en DHHC4, una PAT poco caracterizada. El presente estudio exploró el interactoma de DHHC4 en busca de nuevas proteínas interactuantes, utilizando BioID2 en células humanas HeLa cultivadas. Electroporamos células HeLa con DHHC4-BioID2-HA o BioID2-HA como control. Las diferencias en la biotinilación de proteínas entre los tratamientos se confirmaron mediante inmunoblotting en células HeLa. A continuación, confirmamos la presencia de los constructos en el retículo endoplasmático mediante microscopía de inmunofluorescencia indirecta. En el experimento de LC-MS, nuestros resultados preliminares detectaron x proteínas interactuantes que podrían representar nuevos reguladores o dianas potenciales de DHHC4. En un intento por identificar posibles sustratos en la lista de proteínas interactuantes encontradas, hemos buscado sitios de palmitoilación predichos en todas las proteínas identificadas mediante el software SwissPalm. Actualmente estamos confirmando estos resultados aumentando las réplicas y validando el estado de palmitoilación de algunas de estas proteínas. De esta manera, podrían haberse identificado nuevos reguladores o dianas de DHHC4, lo que contribuiría a futuras investigaciones sobre la palmitoilación.Fil: Meinero, Rocío del Milagro. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.Fil: Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba (CIQUIBIC); Argentina.Fil: Valdez Taubas, Javier. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.Fil: Valdez Taubas, Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina..Biología Celular, Microbiologíahttps://orcid.org/0009-0004-0993-8860https://orcid.org/0000-0002-2806-94192022info:eu-repo/semantics/conferenceObjectinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionhttp://purl.org/coar/resource_type/c_5794info:ar-repo/semantics/documentoDeConferenciaapplication/pdfMeinero, R. y Valdez Taubas, J. (noviembre de 2022). Identification of the palmitoyltransferase DHHC4 interactome using proximity-dependent biotinylation by BioID2. [Resumen]. LVIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación en Bioquímica y Biología Molecular. 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La identificación de asociaciones proteína-proteína es un enfoque fundamental para el estudio de la función proteica y los mecanismos biológicos. BioID (identificación de biotina dependiente de proximidad) es una herramienta novedosa y potente para estudiar las interacciones proteína-proteína in vivo. Este sistema se basa en la fusión de una proteína cebo de interés con una enzima biotina ligasa mutante promiscua capaz de biotinilar los grupos amino de las proteínas vecinas sobre biotina. Posteriormente, las proteínas biotiniladas pueden aislarse selectivamente mediante métodos convencionales de captura de biotina e identificarse mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Una de las mayores ventajas de BioID2 es que no se limita a los ligandos directos, ya que puede detectar interacciones débiles y transitorias entre proteínas a lo largo del tiempo. Además, este enfoque no requiere reactivos tóxicos y es sencillo de usar. La S-acilación es una modificación postraduccional común de las proteínas celulares que implica la unión de ácidos grasos a un residuo de cisteína. Esta modificación es reversible y regula procesos de gran importancia biológica; muchas enfermedades están relacionadas con alteraciones en la S-acilación. Una familia de enzimas llamadas palmitoiltransferasas (PAT) cataliza esta modificación. Existen 23 miembros de esta familia (DHHC1-23) en el genoma humano y la información sobre ellos aún es limitada y sigue creciendo. Aquí, centramos nuestra investigación en DHHC4, una PAT poco caracterizada. El presente estudio exploró el interactoma de DHHC4 en busca de nuevas proteínas interactuantes, utilizando BioID2 en células humanas HeLa cultivadas. Electroporamos células HeLa con DHHC4-BioID2-HA o BioID2-HA como control. Las diferencias en la biotinilación de proteínas entre los tratamientos se confirmaron mediante inmunoblotting en células HeLa. A continuación, confirmamos la presencia de los constructos en el retículo endoplasmático mediante microscopía de inmunofluorescencia indirecta. En el experimento de LC-MS, nuestros resultados preliminares detectaron x proteínas interactuantes que podrían representar nuevos reguladores o dianas potenciales de DHHC4. En un intento por identificar posibles sustratos en la lista de proteínas interactuantes encontradas, hemos buscado sitios de palmitoilación predichos en todas las proteínas identificadas mediante el software SwissPalm. Actualmente estamos confirmando estos resultados aumentando las réplicas y validando el estado de palmitoilación de algunas de estas proteínas. De esta manera, podrían haberse identificado nuevos reguladores o dianas de DHHC4, lo que contribuiría a futuras investigaciones sobre la palmitoilación.
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