Optimización de condiciones experimentales para la identificación de ADN de Trypanosoma evansi

Autores
Busellato, Maria Victoria
Año de publicación
2025
Idioma
español castellano
Tipo de recurso
documento de conferencia
Estado
versión publicada
Descripción
Fil: Busellato, Maria Victoria. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.
Fil: De Biasio, María Bárbara. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.
Fil: Maruñak, Silvana Licia. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.
Fil: Montesi, Alicia Monica. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.
La Trypanosomiasis equina es una enfermedad de alta prevalencia en zona de humedales donde habitan animales que actúan como reservorios. Su curso agudo, paresiante o crónico, anemizante ponen en riesgo la vida del paciente. El diagnóstico específico a través de la detección del genoma parasitario mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es útil para la implementación temprana de medidas profilácticas y terapéuticas apropiadas. En el Servicio Veterinario de Biología Molecular se optimizaron las condiciones químicas y térmicas para la realización de PCR con la cual se amplificó un fragmento del genoma de Trypanosoma evansi. La reacción de PCR sencilla se llevó a cabo en un volumen final de 25ul que contuvo: 1X de Buffer de PCR, 1,0 μM de cada oligonucleótido cebador (TBR1/2 Fw y TBR1/2 Rew); 0,2mM de una mezcla equimolecular de dNTPs, 1.5U de Taq ADN polimerasa y 1,5mM MgCl2. En todos los casos se incorporó un control negativo consistente en agua destilada y controles positivos procedentes de equinos infectados con el parásito, diagnosticados según el método parasitológico directo y pruebas moleculares realizadas en el INTA de la ciudad de Mercedes. Las condiciones térmicas para la amplificación fueron: desnaturalización inicial: 94°C por 3min, luego 30 ciclos de desnaturalización a 94°C por 60 s; pegado de primer: 60°C por 60 s; extensión: 72°C por 60 s y una extensión final: 72°C por 5min e incubación a 4oC hasta su utilización. El producto de amplificación específico de 164 pb fue separado por electroforesis en gel de agarosa 2% en buffer TBE 1X, teñido con bromuro de etidio y visualizado por transiluminación UV. Los oligonucleótidos utilizados son específicos de secuencias de ADN repetitivo en minicromosomas de T. evansi. Como resultado se observaron bandas de amplificación detectables del tamaño esperado (164 pb) en las muestras pertenecientes a los controles positivos, mientras que en muestras de control negativo las mismas no fueron observadas, corroborando un resultado exitoso de las condiciones utilizadas en la técnica. También se realizó una prueba de gradiente de temperatura con 60oC-61oC-62oC para la hibridización de cebadores, con el fin de determinar la temperatura óptima a la que los mismos se unen específicamente a la secuencia de ADN objetivo. En todos los casos se empleó un control positivo y un negativo con las mismas condiciones químicas antes mencionadas. La electroforesis en agarosa al 2% en buffer TBE 1X, teñido con bromuro de etidio, demostró a través de transiluminación UV una banda esperada de 164pb en el control positivo y ausencia de bandas inespecíficas en el tubo correspondiente a 62oC de hibridización. Estos datos nos permitirán seguir realizando pruebas de sensibilidad y especificidad necesarias para mejorar el diagnóstico de la enfermedad.
Materia
ADN
PCR
Trypanosoma
Nivel de accesibilidad
acceso abierto
Condiciones de uso
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/
Repositorio
Repositorio Institucional de la Universidad Nacional del Nordeste (UNNE)
Institución
Universidad Nacional del Nordeste
OAI Identificador
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La Trypanosomiasis equina es una enfermedad de alta prevalencia en zona de humedales donde habitan animales que actúan como reservorios. Su curso agudo, paresiante o crónico, anemizante ponen en riesgo la vida del paciente. El diagnóstico específico a través de la detección del genoma parasitario mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es útil para la implementación temprana de medidas profilácticas y terapéuticas apropiadas. En el Servicio Veterinario de Biología Molecular se optimizaron las condiciones químicas y térmicas para la realización de PCR con la cual se amplificó un fragmento del genoma de Trypanosoma evansi. La reacción de PCR sencilla se llevó a cabo en un volumen final de 25ul que contuvo: 1X de Buffer de PCR, 1,0 μM de cada oligonucleótido cebador (TBR1/2 Fw y TBR1/2 Rew); 0,2mM de una mezcla equimolecular de dNTPs, 1.5U de Taq ADN polimerasa y 1,5mM MgCl2. En todos los casos se incorporó un control negativo consistente en agua destilada y controles positivos procedentes de equinos infectados con el parásito, diagnosticados según el método parasitológico directo y pruebas moleculares realizadas en el INTA de la ciudad de Mercedes. Las condiciones térmicas para la amplificación fueron: desnaturalización inicial: 94°C por 3min, luego 30 ciclos de desnaturalización a 94°C por 60 s; pegado de primer: 60°C por 60 s; extensión: 72°C por 60 s y una extensión final: 72°C por 5min e incubación a 4oC hasta su utilización. El producto de amplificación específico de 164 pb fue separado por electroforesis en gel de agarosa 2% en buffer TBE 1X, teñido con bromuro de etidio y visualizado por transiluminación UV. Los oligonucleótidos utilizados son específicos de secuencias de ADN repetitivo en minicromosomas de T. evansi. Como resultado se observaron bandas de amplificación detectables del tamaño esperado (164 pb) en las muestras pertenecientes a los controles positivos, mientras que en muestras de control negativo las mismas no fueron observadas, corroborando un resultado exitoso de las condiciones utilizadas en la técnica. También se realizó una prueba de gradiente de temperatura con 60oC-61oC-62oC para la hibridización de cebadores, con el fin de determinar la temperatura óptima a la que los mismos se unen específicamente a la secuencia de ADN objetivo. En todos los casos se empleó un control positivo y un negativo con las mismas condiciones químicas antes mencionadas. La electroforesis en agarosa al 2% en buffer TBE 1X, teñido con bromuro de etidio, demostró a través de transiluminación UV una banda esperada de 164pb en el control positivo y ausencia de bandas inespecíficas en el tubo correspondiente a 62oC de hibridización. Estos datos nos permitirán seguir realizando pruebas de sensibilidad y especificidad necesarias para mejorar el diagnóstico de la enfermedad.
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