Aplicación de citometría de flujo para el análisis de polen de arándano (Vaccinium corymbosum)

Autores
Recalde, José María
Año de publicación
2025
Idioma
español castellano
Tipo de recurso
documento de conferencia
Estado
versión publicada
Descripción
Fil: Recalde, José María. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Botánica del Nordeste; Argentina.
Fil: Alayón Luaces, Paula. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentina.
Fil: Garavello, Miguel Fernando. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentina.
En Argentina, el cultivo de arándanos (Vaccinium corymbosum L.) abarcó 2100 hectáreas en la campaña 2023/2024. Una de las regiones más importantes es el Nordeste argentino, donde la mayor superficie en producción se ubica en la provincia de Entre Ríos. Los cultivares más implantados en el país son ‘Emerald’, caracterizado por su vigor, productividad y vida poscosecha de los frutos, y ‘Snowchaser’, que ofrece una producción temprana y la posibilidad de adaptarse al sistema “siempre-verde”, que anticipa aún más la cosecha. La citometría de flujo es una herramienta eficiente y ampliamente utilizada para analizar el contenido de ADN en plantas desde la década de 1980. Su aplicación en células somáticas se ha orientado al estudio del tamaño del genoma y la determinación del nivel de ploidía, tanto en investigaciones básicas como en programas de mejoramiento genético. En el caso de las células reproductivas, los análisis de polen han abarcado un amplio rango, desde las células madre de las microsporas hasta los granos de polen maduros. En particular, esta técnica ha resultado útil para detectar gametos no reducidos, los cuales desempeñan un papel clave en la poliploidización natural y en la generación de híbridos poliploides con fines de mejoramiento. Sin embargo, la obtención de núcleos intactos a partir de granos de polen presenta desafíos técnicos, principalmente debido a las características estructurales de su pared, que varían entre especies. Estas dificultades pueden limitar la factibilidad del análisis o afectar la calidad de los datos obtenidos. En V. corymbosum y otras especies de Vaccinium se han realizado numerosos análisis por citometría en células foliares, para determinar su nivel de ploidía y contenido de ADN, siendo V. corymbosum una especie tetraploide (2n = 4x = 48). Por otro lado, existen precedentes de estudios de gametos no reducidos en V. corymbosum y otras especies del género, pero mediante la detección de mónadas o díadas de polen por microscopía óptica. A pesar de su potencial para estudios reproductivos y aplicaciones en mejoramiento genético, en V. corymbosum no se han reportado hasta el momento estudios de citometría de flujo aplicados al análisis de polen. El objetivo del presente trabajo fue establecer una metodología para el análisis del nivel de ploidía de granos de polen de V. corymbosum mediante citometría de flujo. Para ello, se analizaron muestras de los cultivares ‘Emerald’ y ‘Snowchaser’, provenientes de establecimientos ubicados en Concordia, Entre Ríos. Se colectaron botones florales en estadios previos a la antesis para la extracción de polen, y hojas completamente desarrolladas del cultivar ‘Snowchaser’. Se utilizó citometría de flujo para determinar el nivel de ploidía de las hojas control y los granos de polen maduros. Las muestras de hoja fueron trituradas y colocadas en una solución tampón de extracción de núcleos Cy.Stain UV Precise P (Extraction buffer). Posteriormente, los núcleos fueron filtrados mediante un filtro de 30 μm y teñidos con DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) Cy-Satin UV Precise P (Staining Buffer). Para el procesamiento del polen, se empleó un método de filtración con ruptura mecánica, que consistió en el uso de un pre-filtro de 50 μm seguido de un filtro de 20 μm. El material retenido en este último fue sometido a fricción para facilitar la liberación de los núcleos, que luego fueron teñidos de acuerdo con el procedimiento previamente descrito. El nivel de fluorescencia fue analizado mediante un citómetro de flujo CyFlow Space (Sysmex Partec), en el Instituto de Botánica del Nordeste (IBONE). Los núcleos de granos de polen analizados de los cultivares ‘Emerald’ y ‘Snowchaser’ presentaron histogramas con picos de fluorescencia con la mitad del valor observado en los histogramas foliares, lo cual indica un que el nivel de ploidía de los gametos es de n = 2x. Los resultados obtenidos son consistentes con el contenido genético esperado en gametos de cultivares tetraploides. Se concluye que es factible el análisis de granos de polen de V. corymbosum mediante citometría de flujo con la metodología desarrollada, obteniéndose histogramas claros y consistentes. La consolidación de esta técnica facilitará el desarrollo de estudios sobre núcleos de polen en V. corymbosum, tanto en investigaciones básicas como en programas de mejoramiento genético.
Materia
Aislamiento de núcleos
Fruta fina
Gametos masculinos
Nivel de accesibilidad
acceso abierto
Condiciones de uso
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/
Repositorio
Repositorio Institucional de la Universidad Nacional del Nordeste (UNNE)
Institución
Universidad Nacional del Nordeste
OAI Identificador
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Los cultivares más implantados en el país son ‘Emerald’, caracterizado por su vigor, productividad y vida poscosecha de los frutos, y ‘Snowchaser’, que ofrece una producción temprana y la posibilidad de adaptarse al sistema “siempre-verde”, que anticipa aún más la cosecha. La citometría de flujo es una herramienta eficiente y ampliamente utilizada para analizar el contenido de ADN en plantas desde la década de 1980. Su aplicación en células somáticas se ha orientado al estudio del tamaño del genoma y la determinación del nivel de ploidía, tanto en investigaciones básicas como en programas de mejoramiento genético. En el caso de las células reproductivas, los análisis de polen han abarcado un amplio rango, desde las células madre de las microsporas hasta los granos de polen maduros. En particular, esta técnica ha resultado útil para detectar gametos no reducidos, los cuales desempeñan un papel clave en la poliploidización natural y en la generación de híbridos poliploides con fines de mejoramiento. Sin embargo, la obtención de núcleos intactos a partir de granos de polen presenta desafíos técnicos, principalmente debido a las características estructurales de su pared, que varían entre especies. Estas dificultades pueden limitar la factibilidad del análisis o afectar la calidad de los datos obtenidos. En V. corymbosum y otras especies de Vaccinium se han realizado numerosos análisis por citometría en células foliares, para determinar su nivel de ploidía y contenido de ADN, siendo V. corymbosum una especie tetraploide (2n = 4x = 48). Por otro lado, existen precedentes de estudios de gametos no reducidos en V. corymbosum y otras especies del género, pero mediante la detección de mónadas o díadas de polen por microscopía óptica. A pesar de su potencial para estudios reproductivos y aplicaciones en mejoramiento genético, en V. corymbosum no se han reportado hasta el momento estudios de citometría de flujo aplicados al análisis de polen. El objetivo del presente trabajo fue establecer una metodología para el análisis del nivel de ploidía de granos de polen de V. corymbosum mediante citometría de flujo. Para ello, se analizaron muestras de los cultivares ‘Emerald’ y ‘Snowchaser’, provenientes de establecimientos ubicados en Concordia, Entre Ríos. Se colectaron botones florales en estadios previos a la antesis para la extracción de polen, y hojas completamente desarrolladas del cultivar ‘Snowchaser’. Se utilizó citometría de flujo para determinar el nivel de ploidía de las hojas control y los granos de polen maduros. Las muestras de hoja fueron trituradas y colocadas en una solución tampón de extracción de núcleos Cy.Stain UV Precise P (Extraction buffer). Posteriormente, los núcleos fueron filtrados mediante un filtro de 30 μm y teñidos con DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) Cy-Satin UV Precise P (Staining Buffer). Para el procesamiento del polen, se empleó un método de filtración con ruptura mecánica, que consistió en el uso de un pre-filtro de 50 μm seguido de un filtro de 20 μm. El material retenido en este último fue sometido a fricción para facilitar la liberación de los núcleos, que luego fueron teñidos de acuerdo con el procedimiento previamente descrito. El nivel de fluorescencia fue analizado mediante un citómetro de flujo CyFlow Space (Sysmex Partec), en el Instituto de Botánica del Nordeste (IBONE). Los núcleos de granos de polen analizados de los cultivares ‘Emerald’ y ‘Snowchaser’ presentaron histogramas con picos de fluorescencia con la mitad del valor observado en los histogramas foliares, lo cual indica un que el nivel de ploidía de los gametos es de n = 2x. Los resultados obtenidos son consistentes con el contenido genético esperado en gametos de cultivares tetraploides. Se concluye que es factible el análisis de granos de polen de V. corymbosum mediante citometría de flujo con la metodología desarrollada, obteniéndose histogramas claros y consistentes. La consolidación de esta técnica facilitará el desarrollo de estudios sobre núcleos de polen en V. corymbosum, tanto en investigaciones básicas como en programas de mejoramiento genético.Universidad Nacional del Nordeste. Secretaría General de Ciencia y TécnicaAlayón Luaces, PaulaGaravello, Miguel Fernando2025-06-11info:eu-repo/semantics/conferenceObjectinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionhttp://purl.org/coar/resource_type/c_5794info:ar-repo/semantics/documentoDeConferenciaapplication/pdfp. 1-1application/pdfRecalde, José María, 2025. Aplicación de citometría de flujo para el análisis de polen de arándano (Vaccinium corymbosum). En: XXX Reunión de Comunicaciones Científicas y Tecnológicas. Resistencia: Universidad Nacional del Nordeste. Secretaría General de Ciencia y Técnica, p. 1-1.https://repositorio.unne.edu.ar/handle/123456789/60646spaUNNE/PI/22A002/AR. 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En Argentina, el cultivo de arándanos (Vaccinium corymbosum L.) abarcó 2100 hectáreas en la campaña 2023/2024. Una de las regiones más importantes es el Nordeste argentino, donde la mayor superficie en producción se ubica en la provincia de Entre Ríos. Los cultivares más implantados en el país son ‘Emerald’, caracterizado por su vigor, productividad y vida poscosecha de los frutos, y ‘Snowchaser’, que ofrece una producción temprana y la posibilidad de adaptarse al sistema “siempre-verde”, que anticipa aún más la cosecha. La citometría de flujo es una herramienta eficiente y ampliamente utilizada para analizar el contenido de ADN en plantas desde la década de 1980. Su aplicación en células somáticas se ha orientado al estudio del tamaño del genoma y la determinación del nivel de ploidía, tanto en investigaciones básicas como en programas de mejoramiento genético. En el caso de las células reproductivas, los análisis de polen han abarcado un amplio rango, desde las células madre de las microsporas hasta los granos de polen maduros. En particular, esta técnica ha resultado útil para detectar gametos no reducidos, los cuales desempeñan un papel clave en la poliploidización natural y en la generación de híbridos poliploides con fines de mejoramiento. Sin embargo, la obtención de núcleos intactos a partir de granos de polen presenta desafíos técnicos, principalmente debido a las características estructurales de su pared, que varían entre especies. Estas dificultades pueden limitar la factibilidad del análisis o afectar la calidad de los datos obtenidos. En V. corymbosum y otras especies de Vaccinium se han realizado numerosos análisis por citometría en células foliares, para determinar su nivel de ploidía y contenido de ADN, siendo V. corymbosum una especie tetraploide (2n = 4x = 48). Por otro lado, existen precedentes de estudios de gametos no reducidos en V. corymbosum y otras especies del género, pero mediante la detección de mónadas o díadas de polen por microscopía óptica. A pesar de su potencial para estudios reproductivos y aplicaciones en mejoramiento genético, en V. corymbosum no se han reportado hasta el momento estudios de citometría de flujo aplicados al análisis de polen. El objetivo del presente trabajo fue establecer una metodología para el análisis del nivel de ploidía de granos de polen de V. corymbosum mediante citometría de flujo. Para ello, se analizaron muestras de los cultivares ‘Emerald’ y ‘Snowchaser’, provenientes de establecimientos ubicados en Concordia, Entre Ríos. Se colectaron botones florales en estadios previos a la antesis para la extracción de polen, y hojas completamente desarrolladas del cultivar ‘Snowchaser’. Se utilizó citometría de flujo para determinar el nivel de ploidía de las hojas control y los granos de polen maduros. Las muestras de hoja fueron trituradas y colocadas en una solución tampón de extracción de núcleos Cy.Stain UV Precise P (Extraction buffer). Posteriormente, los núcleos fueron filtrados mediante un filtro de 30 μm y teñidos con DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) Cy-Satin UV Precise P (Staining Buffer). Para el procesamiento del polen, se empleó un método de filtración con ruptura mecánica, que consistió en el uso de un pre-filtro de 50 μm seguido de un filtro de 20 μm. El material retenido en este último fue sometido a fricción para facilitar la liberación de los núcleos, que luego fueron teñidos de acuerdo con el procedimiento previamente descrito. El nivel de fluorescencia fue analizado mediante un citómetro de flujo CyFlow Space (Sysmex Partec), en el Instituto de Botánica del Nordeste (IBONE). Los núcleos de granos de polen analizados de los cultivares ‘Emerald’ y ‘Snowchaser’ presentaron histogramas con picos de fluorescencia con la mitad del valor observado en los histogramas foliares, lo cual indica un que el nivel de ploidía de los gametos es de n = 2x. Los resultados obtenidos son consistentes con el contenido genético esperado en gametos de cultivares tetraploides. Se concluye que es factible el análisis de granos de polen de V. corymbosum mediante citometría de flujo con la metodología desarrollada, obteniéndose histogramas claros y consistentes. La consolidación de esta técnica facilitará el desarrollo de estudios sobre núcleos de polen en V. corymbosum, tanto en investigaciones básicas como en programas de mejoramiento genético.
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