Estandarización de una técnica de biología molecular para detección de coronavirus en muestras de murciélagos y primera identificación en especies insectívoras que habitan la ciuda...

Autores: Salinas, Florencia Marcela
Año de publicación: 2025
Idioma: español castellano
Tipo de recurso: documento de conferencia
Estado: versión publicada
Descripción: Fil: Salinas, Florencia Marcela. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.
Fil: Ruiz, Raquel Monica. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.
Fil: Ramírez, Gabriela Verónica. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.
Los Coronavirus (CoV), al ser virus altamente recombinables, poseen la capacidad de saltar y adaptarse a nuevos huéspedes. Posee cuatro géneros, de los cuales AlphaCoV y BetaCoV se encuentran presentes en mamíferos, entre ellos los murciélagos y el hombre. En Argentina es limitada la información sobre las técnicas de biología molecular capaces de detectar CoV en muestras de animales. La provincia de Corrientes no dispone de trabajos realizado sobre técnicas de biología molecular para detectar CoV en murciélagos, siendo esta especie importante por el rol que posee de reservorio, lo cual fue demostrado en otros países. Debido a esta situación, el objetivo general del proyecto de beca es estudiar poblaciones de murciélagos de la ciudad de Corrientes (hábitat, hábitos e identificación), poner a punto técnicas de biología molecular capaces de detectar CoV en muestras de murciélagos de la ciudad de Corrientes y generar datos epidemiológicos de circulación viral. En trabajos previos del proyecto mayor del cual se desprende el presente trabajo, se identificaron refugios y especies de murciélagos, de los cuales se extrajeron diferentes muestras, por lo que el objetivo general del presente trabajo fue el de optimizar parámetros para poner a punto una técnica de biología molecular para luego ser aplicada en la detección de CoV en muestras obtenidas de murciélagos que habitan la ciudad de Corrientes y como objetivos específicos nos planteamos optimizar los parámetros de una técnica de extracción de ARN para obtención de ADNc de muestras de hisopados bucales, hisopados urogenitales y materia fecal de murciélagos y detectar CoV en las distintas muestras de murciélagos aplicando la técnica optimizada de bilogía molecular. Para el desarrollo metodológico del trabajo, se utilizaron muestras de hisopados bucales y urogenitales y materia fecal. Se trabajaron con 45 muestras (15 de hisopados bucales, 15 de hisopados urogenitales y 15 de materia fecal). Teniendo como base la técnica de Vijgen et al. (2008), se procedió de la siguiente manera: las muestras de materia fecal se acondicionaron individualmente y se homogeneizaron por medio de vortex y se extrajo 80 microlitros (μl) del medio. Las muestras de hisopados se organizaron en pooles de acuerdo a diferentes características, para lo cual cada criovial con su hisopo se homogenizó a través de vortex y luego se extrajo 80 μl de cada criovial para conformar pooles. Se probaron diferentes diluciones y homogenización, diferente a la técnica utilizada de base. Posteriormente, a las muestras de materia fecal y pooles se les realizó el aislamiento y purificación de ARN con el uso de un Kit comercial QIAamp® Viral RNA Mini-kit. La obtención de ADNc (ácido desoxirribonucleico complementario) y detección de coronavirus se modificó con respecto a la técnica original aplicando dos pasos: El ARN purificado se sometió a una reacción de transcripción reversa mediante una enzima HIGHT CAPACITY CDNA para obtener ADNc. A los 15 μl del volumen final se adicionaron 15 μl del ARN y se la somete a un programa de termociclado. Para la detección de COV por RT-PCR PAN: se preparó la Mix para RT-PCR PAN, para detectar diversos CoV. Se utilizaron tres controles negativos y un control positivo. Para el termociclado se utilizó el programa PANCORR. La visualización de los resultados se realizó en geles de agarosa al 1,5%. Para los resultados obtenidos podemos decir que Vijgen, et al. (2008) estandarizó su técnica para muestras de tejidos de diferentes consistencias a las nuestras y las sometió a diluciones las cuales no se encontraban descriptas, para lo cual en este trabajo implementamos un acondicionamiento especial con respecto a la homogenización de muestras para materia fecal. La técnica de Vijgen, et al. (2008) simplifica el procesamiento en la obtención del ARN purificado, por un lado, mientras que la obtención de ADNc y la detección de coronavirus por RT-PCR PAN lo realiza en un solo paso posterior. En nuestro caso, la técnica se adaptó a 3 pasos, separando la obtención de ADNc por un lado y la detección final de coronavirus por otro, que a pesar de ser más laboriosa tuvimos la ventaja de utilizar menos reactivos. En el presente trabajo utilizamos los mismos primers y concentración en mmol que el autor, pero al no obtener bandas visibles, se ajustó la concentración hasta lograr su visualización. Se aplicó la técnica modificada a todas las muestras y se detectaron 6 muestras positivas de materia fecal (bandas visibles en 251 pb), pertenecientes a 2 animales de la especie Molosus rufus y 4 de la especie Eumops patagonicus. Nuestros resultados coinciden con estudios en murciélagos de Brasil en la detección de CoV en muestras de materia fecal de murciélagos, sin embargo, los autores utilizaron pooles y aplicaron un Kit de extracción diferente. Con respecto al porcentaje de muestras detectadas positivas podríamos interpretar, hasta el momento, un alto porcentaje (21%), si comparamos con otros trabajos realizados sobre murciélagos que habitan áreas urbanas de Brasil que utilizaron pooles de materia fecal y obtuvieron 19%, u otros autores que trabajaron con muestras individuales de materia fecal de murciélagos de Italia y obtuvieron un porcentaje de 10%. Nuestros resultados negativos en muestras de hisopados podrían deberse a la baja carga viral o a la organización en pooles ya que otros autores obtuvieron detección positiva en hisopados orofaríngeos, pero los mismos fueron procesados en forma individual. Podemos concluir que se lograron alcanzar los objetivos planteados para este trabajo logrando la optimización de la técnica empleada por Vijgen et al, (2008) para ser aplicado en forma eficiente con sus modificaciones en hisopados y materia fecal de murciélagos y obtener el primer reporte de especies de murciélagos positivos a CoV en la Ciudad de Corrientes, cuyos datos registrados formarán parte de la vigilancia epidemiológica en animales silvestres de este patógeno viral.
Materia: Reacción en cadena de la Polimerasa
Pancoronavirus
Quirópteros
Nivel de accesibilidad: acceso abierto
Condiciones de uso: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/
Repositorio
Institución: Universidad Nacional del Nordeste
OAI Identificador: oai:repositorio.unne.edu.ar:123456789/60585

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En Argentina es limitada la información sobre las técnicas de biología molecular capaces de detectar CoV en muestras de animales. La provincia de Corrientes no dispone de trabajos realizado sobre técnicas de biología molecular para detectar CoV en murciélagos, siendo esta especie importante por el rol que posee de reservorio, lo cual fue demostrado en otros países. Debido a esta situación, el objetivo general del proyecto de beca es estudiar poblaciones de murciélagos de la ciudad de Corrientes (hábitat, hábitos e identificación), poner a punto técnicas de biología molecular capaces de detectar CoV en muestras de murciélagos de la ciudad de Corrientes y generar datos epidemiológicos de circulación viral. En trabajos previos del proyecto mayor del cual se desprende el presente trabajo, se identificaron refugios y especies de murciélagos, de los cuales se extrajeron diferentes muestras, por lo que el objetivo general del presente trabajo fue el de optimizar parámetros para poner a punto una técnica de biología molecular para luego ser aplicada en la detección de CoV en muestras obtenidas de murciélagos que habitan la ciudad de Corrientes y como objetivos específicos nos planteamos optimizar los parámetros de una técnica de extracción de ARN para obtención de ADNc de muestras de hisopados bucales, hisopados urogenitales y materia fecal de murciélagos y detectar CoV en las distintas muestras de murciélagos aplicando la técnica optimizada de bilogía molecular. Para el desarrollo metodológico del trabajo, se utilizaron muestras de hisopados bucales y urogenitales y materia fecal. Se trabajaron con 45 muestras (15 de hisopados bucales, 15 de hisopados urogenitales y 15 de materia fecal). Teniendo como base la técnica de Vijgen et al. (2008), se procedió de la siguiente manera: las muestras de materia fecal se acondicionaron individualmente y se homogeneizaron por medio de vortex y se extrajo 80 microlitros (μl) del medio. Las muestras de hisopados se organizaron en pooles de acuerdo a diferentes características, para lo cual cada criovial con su hisopo se homogenizó a través de vortex y luego se extrajo 80 μl de cada criovial para conformar pooles. Se probaron diferentes diluciones y homogenización, diferente a la técnica utilizada de base. Posteriormente, a las muestras de materia fecal y pooles se les realizó el aislamiento y purificación de ARN con el uso de un Kit comercial QIAamp® Viral RNA Mini-kit. La obtención de ADNc (ácido desoxirribonucleico complementario) y detección de coronavirus se modificó con respecto a la técnica original aplicando dos pasos: El ARN purificado se sometió a una reacción de transcripción reversa mediante una enzima HIGHT CAPACITY CDNA para obtener ADNc. A los 15 μl del volumen final se adicionaron 15 μl del ARN y se la somete a un programa de termociclado. Para la detección de COV por RT-PCR PAN: se preparó la Mix para RT-PCR PAN, para detectar diversos CoV. Se utilizaron tres controles negativos y un control positivo. Para el termociclado se utilizó el programa PANCORR. La visualización de los resultados se realizó en geles de agarosa al 1,5%. Para los resultados obtenidos podemos decir que Vijgen, et al. (2008) estandarizó su técnica para muestras de tejidos de diferentes consistencias a las nuestras y las sometió a diluciones las cuales no se encontraban descriptas, para lo cual en este trabajo implementamos un acondicionamiento especial con respecto a la homogenización de muestras para materia fecal. La técnica de Vijgen, et al. (2008) simplifica el procesamiento en la obtención del ARN purificado, por un lado, mientras que la obtención de ADNc y la detección de coronavirus por RT-PCR PAN lo realiza en un solo paso posterior. En nuestro caso, la técnica se adaptó a 3 pasos, separando la obtención de ADNc por un lado y la detección final de coronavirus por otro, que a pesar de ser más laboriosa tuvimos la ventaja de utilizar menos reactivos. En el presente trabajo utilizamos los mismos primers y concentración en mmol que el autor, pero al no obtener bandas visibles, se ajustó la concentración hasta lograr su visualización. Se aplicó la técnica modificada a todas las muestras y se detectaron 6 muestras positivas de materia fecal (bandas visibles en 251 pb), pertenecientes a 2 animales de la especie Molosus rufus y 4 de la especie Eumops patagonicus. Nuestros resultados coinciden con estudios en murciélagos de Brasil en la detección de CoV en muestras de materia fecal de murciélagos, sin embargo, los autores utilizaron pooles y aplicaron un Kit de extracción diferente. Con respecto al porcentaje de muestras detectadas positivas podríamos interpretar, hasta el momento, un alto porcentaje (21%), si comparamos con otros trabajos realizados sobre murciélagos que habitan áreas urbanas de Brasil que utilizaron pooles de materia fecal y obtuvieron 19%, u otros autores que trabajaron con muestras individuales de materia fecal de murciélagos de Italia y obtuvieron un porcentaje de 10%. Nuestros resultados negativos en muestras de hisopados podrían deberse a la baja carga viral o a la organización en pooles ya que otros autores obtuvieron detección positiva en hisopados orofaríngeos, pero los mismos fueron procesados en forma individual. Podemos concluir que se lograron alcanzar los objetivos planteados para este trabajo logrando la optimización de la técnica empleada por Vijgen et al, (2008) para ser aplicado en forma eficiente con sus modificaciones en hisopados y materia fecal de murciélagos y obtener el primer reporte de especies de murciélagos positivos a CoV en la Ciudad de Corrientes, cuyos datos registrados formarán parte de la vigilancia epidemiológica en animales silvestres de este patógeno viral.Universidad Nacional del Nordeste. Secretaría General de Ciencia y TécnicaRuiz, Raquel MonicaRamírez, Gabriela Verónica2025-06-11info:eu-repo/semantics/conferenceObjectinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionhttp://purl.org/coar/resource_type/c_5794info:ar-repo/semantics/documentoDeConferenciaapplication/pdfp. 1-2application/pdfSalinas, Florencia Marcela, 2025. Estandarización de una técnica de biología molecular para detección de coronavirus en muestras de murciélagos y primera identificación en especies insectívoras que habitan la ciudad de Corrientes. En: XXX Reunión de Comunicaciones Científicas y Tecnológicas. Resistencia: Universidad Nacional del Nordeste. Secretaría General de Ciencia y Técnica, p. 1-2.https://repositorio.unne.edu.ar/handle/123456789/60585spaUNNE/PI/21B006/AR. 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Debido a esta situación, el objetivo general del proyecto de beca es estudiar poblaciones de murciélagos de la ciudad de Corrientes (hábitat, hábitos e identificación), poner a punto técnicas de biología molecular capaces de detectar CoV en muestras de murciélagos de la ciudad de Corrientes y generar datos epidemiológicos de circulación viral. En trabajos previos del proyecto mayor del cual se desprende el presente trabajo, se identificaron refugios y especies de murciélagos, de los cuales se extrajeron diferentes muestras, por lo que el objetivo general del presente trabajo fue el de optimizar parámetros para poner a punto una técnica de biología molecular para luego ser aplicada en la detección de CoV en muestras obtenidas de murciélagos que habitan la ciudad de Corrientes y como objetivos específicos nos planteamos optimizar los parámetros de una técnica de extracción de ARN para obtención de ADNc de muestras de hisopados bucales, hisopados urogenitales y materia fecal de murciélagos y detectar CoV en las distintas muestras de murciélagos aplicando la técnica optimizada de bilogía molecular. Para el desarrollo metodológico del trabajo, se utilizaron muestras de hisopados bucales y urogenitales y materia fecal. Se trabajaron con 45 muestras (15 de hisopados bucales, 15 de hisopados urogenitales y 15 de materia fecal). Teniendo como base la técnica de Vijgen et al. (2008), se procedió de la siguiente manera: las muestras de materia fecal se acondicionaron individualmente y se homogeneizaron por medio de vortex y se extrajo 80 microlitros (μl) del medio. Las muestras de hisopados se organizaron en pooles de acuerdo a diferentes características, para lo cual cada criovial con su hisopo se homogenizó a través de vortex y luego se extrajo 80 μl de cada criovial para conformar pooles. Se probaron diferentes diluciones y homogenización, diferente a la técnica utilizada de base. Posteriormente, a las muestras de materia fecal y pooles se les realizó el aislamiento y purificación de ARN con el uso de un Kit comercial QIAamp® Viral RNA Mini-kit. La obtención de ADNc (ácido desoxirribonucleico complementario) y detección de coronavirus se modificó con respecto a la técnica original aplicando dos pasos: El ARN purificado se sometió a una reacción de transcripción reversa mediante una enzima HIGHT CAPACITY CDNA para obtener ADNc. A los 15 μl del volumen final se adicionaron 15 μl del ARN y se la somete a un programa de termociclado. Para la detección de COV por RT-PCR PAN: se preparó la Mix para RT-PCR PAN, para detectar diversos CoV. Se utilizaron tres controles negativos y un control positivo. Para el termociclado se utilizó el programa PANCORR. La visualización de los resultados se realizó en geles de agarosa al 1,5%. Para los resultados obtenidos podemos decir que Vijgen, et al. (2008) estandarizó su técnica para muestras de tejidos de diferentes consistencias a las nuestras y las sometió a diluciones las cuales no se encontraban descriptas, para lo cual en este trabajo implementamos un acondicionamiento especial con respecto a la homogenización de muestras para materia fecal. La técnica de Vijgen, et al. (2008) simplifica el procesamiento en la obtención del ARN purificado, por un lado, mientras que la obtención de ADNc y la detección de coronavirus por RT-PCR PAN lo realiza en un solo paso posterior. En nuestro caso, la técnica se adaptó a 3 pasos, separando la obtención de ADNc por un lado y la detección final de coronavirus por otro, que a pesar de ser más laboriosa tuvimos la ventaja de utilizar menos reactivos. En el presente trabajo utilizamos los mismos primers y concentración en mmol que el autor, pero al no obtener bandas visibles, se ajustó la concentración hasta lograr su visualización. Se aplicó la técnica modificada a todas las muestras y se detectaron 6 muestras positivas de materia fecal (bandas visibles en 251 pb), pertenecientes a 2 animales de la especie Molosus rufus y 4 de la especie Eumops patagonicus. Nuestros resultados coinciden con estudios en murciélagos de Brasil en la detección de CoV en muestras de materia fecal de murciélagos, sin embargo, los autores utilizaron pooles y aplicaron un Kit de extracción diferente. Con respecto al porcentaje de muestras detectadas positivas podríamos interpretar, hasta el momento, un alto porcentaje (21%), si comparamos con otros trabajos realizados sobre murciélagos que habitan áreas urbanas de Brasil que utilizaron pooles de materia fecal y obtuvieron 19%, u otros autores que trabajaron con muestras individuales de materia fecal de murciélagos de Italia y obtuvieron un porcentaje de 10%. Nuestros resultados negativos en muestras de hisopados podrían deberse a la baja carga viral o a la organización en pooles ya que otros autores obtuvieron detección positiva en hisopados orofaríngeos, pero los mismos fueron procesados en forma individual. Podemos concluir que se lograron alcanzar los objetivos planteados para este trabajo logrando la optimización de la técnica empleada por Vijgen et al, (2008) para ser aplicado en forma eficiente con sus modificaciones en hisopados y materia fecal de murciélagos y obtener el primer reporte de especies de murciélagos positivos a CoV en la Ciudad de Corrientes, cuyos datos registrados formarán parte de la vigilancia epidemiológica en animales silvestres de este patógeno viral.
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