Análisis de los mecanismos asociados a la descarga de cnidocistos y su regulación en Hydra

Autores: Gavazzi, María Victoria
Año de publicación: 2026
Idioma: español castellano
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado: versión aceptada
Colaborador/a o director/a de tesis: Ronderos, Jorge Rafael
Alzugaray, María Eugenia
Descripción: El phylum Cnidaria es considerado el grupo hermano de Bilateria. El origen de los cnidarios se remonta a 700 millones de años atrás y representa uno de los grupos más ancestrales de metazoos con sistema nervioso. La sinapomorfía que reúne a los miembros de este clado es la presencia de un tipo celular especializado conocido como cnidocito. El cnidocito contiene una estructura capsular con un filamento enrollado en su interior, el cnidocisto, el cual cumple funciones como defensa, captura de presas, adhesión al sustrato y construcción de estructuras en las que habitar. Además, desde la membrana de la célula, se proyecta el cnidocil, un complejo mecano-sensitivo cuya activación provoca la descarga del cnidocisto. Las especies del género Hydra (Hydrozoa: Hydridae), descrito por Trembley en 1744, forman parte de las 40 especies dulceacuícolas de cnidarios. Este organismo, ha resultado ser un eficiente y exitoso modelo biológico para el desarrollo de numerosas investigaciones, incluyendo estudios de envejecimiento, neurobiología, regeneración, ecotoxicología, biología del desarrollo, evolución y fisiología. Hydra posee cuatro tipos de cnidocistos: estenoteles, desmonemes, atricos isorrizas y holotricos isorrizas, de los cuales los dos primeros participan en la captura de presas, mientras que el tercer y cuarto tipo están involucrados en la adhesión al sustrato y la defensa, respectivamente. Los cnidocistos se ubican principalmente a nivel de los tentáculos, y se organizan formando los denominados “complejos de batería celular”. Cada complejo está formado por cnidocitos que se asocian a una célula epiteliomuscular y neuronas, e integra señales mecánicas y químicas del entorno, las cuales representan los estímulos que inducen su descarga. Además, dada la asociación de las baterías con células nerviosas, la estimulación de un cnidocisto causa también la descarga de otros ubicados a cierta distancia. Dado que la descarga del cnidocisto es un proceso irreversible, resulta fundamental que este mecanismo sea finamente regulado y se active sólo bajo las condiciones adecuadas. Se ha postulado que la descarga de los cnidocistos asociados a la captura de presas requiere de la presencia conjunta de estímulos químicos, encargados de sensibilizar al cnidocisto, y de estímulos mecánicos, que activan al sistema mecanorreceptor en el cnidocil. Dentro de las señales químicas que recibe el cnidocito se encuentra el glutatión reducido (GSH), un tripéptido contenido en todas las células animales, que es liberado cuando la presa es lastimada. Dicho compuesto ha demostrado estimular el comportamiento alimentario de Hydra, incluyendo la descarga de cnidocistos. A partir de estos estudios se ha propuesto que el GSH sensibiliza a la célula para reaccionar frente a un estímulo mecánico, pero no causaría la descarga por sí mismo. Más allá de los estímulos involucrados, se ha demostrado que la descarga es un proceso dependiente de calcio (Ca2+). Estudios realizados en hidrozoos y antozoos demuestran que la disminución de los niveles de Ca2+ extracelular inhibe la descarga. Las células disponen de dos mecanismos para aumentar la concentración citosólica de este ion: la entrada desde el medio extracelular y/o la liberación desde depósitos intracelulares. Respecto de los mecanismos relacionados con la descarga de cnidocistos, se ha observado en anémonas que la entrada de Ca2+ ocurre a través de canales dependientes de voltaje (VGCC) tipo L, mientras que, en Hydra sp., se propuso que el ingreso de calcio ocurre a través de un tipo de receptor de potencial transitorio (TRP). Además de su ingreso desde el medio extracelular, varios estudios muestran que el aumento de la concentración del Ca2+ citosólico depende además de su liberación desde el retículo endoplásmico (RE). Para mantener la homeostasis, los metazoos necesitan mecanismos de comunicación intercelular. Estos mecanismos de comunicación han evolucionado a partir de un ancestro común y se han conservado a lo largo de la evolución. En nuestro laboratorio estudiamos aspectos fisiológicos y evolutivos de sistemas de comunicación basados en neuropéptidos en modelos animales de insectos hemípteros (Triatoma infestans y Rhodnius prolixus) y el cnidario de agua dulce Hydra sp. Específicamente estudiamos los neuropéptidos pleiotrópicos allatotropina (AT) y allatostatina-C (AST-C), los cuales, entre otras funciones, son reguladores de la contracción muscular en diferentes sistemas fisiológicos. En Hydra, AT y AST-C actúan como mioreguladores durante el comportamiento alimentario. El tratamiento con AT provoca un incremento en la longitud del hipostoma (estructura donde se ubica la boca), mimetizando el efecto desencadenado por la presencia de alimento. Por su parte, AST-C tiene efecto en el largo del cuerpo, aumenta la actividad de los tentáculos y la actividad contráctil de la cavidad gastrovascular donde genera ondas peristálticas, similares a las desencadenadas luego de la ingesta. Además, este neuropéptido antagoniza el efecto de AT y del alimento sobre la extrusión del hipostoma. La posición basal de los cnidarios en el árbol filogenético nos provee una valiosa oportunidad para conocer el origen y la evolución de los sistemas de comunicación. Los receptores de AT y AST-C presentan un alto grado de homología con los de orexina y somatostatina en vertebrados, lo que muestra que estos sistemas surgieron tempranamente en la evolución, conservando los roles basales y adquiriendo nuevos. De igual forma, el sistema de serotonina (5-HT) es también un sistema ancestral y ampliamente distribuido en la naturaleza. 5-HT es una amina biogénica, conocida en mamíferos por su papel en la regulación de la contracción de la musculatura lisa vascular y la peristalsis del tubo digestivo, como así también, a nivel del sistema nervioso central en donde cumple distintas funciones. En invertebrados (moluscos, nematodes, anélidos, artrópodos), también se ha demostrado que interviene en funciones como la modulación de la alimentación, la locomoción, los ritmos circadianos, la diuresis y el aprendizaje, sin embargo, este sistema ha sido poco estudiado en metazoos basales. En cnidarios, se ha propuesto la participación de serotonina en la regulación de procesos como la contracción muscular, la descarga de cnidocistos y la metamorfosis de la larva plánula. Experimentos preliminares de nuestro laboratorio, sugieren que serotonina posee funciones mioregulatorias relacionadas al comportamiento alimentario en Hydra sp. Sin embargo, las vías de señalización que activaría este mensajero aún son desconocidas. El presente trabajo de Tesis Doctoral tiene como objetivo principal el análisis de los mecanismos que regulan la liberación de cnidocistos en Hydra sp. Se buscó comprender la respuesta frente a estímulos químicos y mecánicos a través de la exposición a estímulos naturales, como las presas vivas y/o señales químicas liberadas por estas al ser heridas. Estudiamos su regulación por mensajeros celulares como 5-HT, AT y AST-C y las correspondientes vías de señalización activadas. En primera instancia, se realizó la diagnosis a nivel específico de las dos colonias de hidras establecidas en nuestro laboratorio. La toma y posterior análisis de diferentes caracteres morfológicos permitió identificar a nuestras colonias como Hydra viridissima, e Hydra vulgaris. Con el objetivo de analizar la relevancia de los estímulos químicos sobre la descarga de cnidocistos, y teniendo en cuenta que se asume que es necesaria la exposición a estímulos químicos y mecánicos simultáneamente para activar este mecanismo, expusimos hidras a tres condiciones: i.e. larvas vivas de Artemia salina (estimulo mecánico y químico), homogenato de larvas de artemias y GSH (ambos estímulos exclusivamente químicos). Las tres condiciones generaron un aumento similar en la cantidad de desmonemes descargados, demostrando que, al menos en nuestro sistema de estudio, el estímulo químico por sí solo es suficiente para inducir la descarga. Una vez confirmado su efecto estimulatorio, elegimos al GSH para corroborar la dependencia de Ca2+ de este mecanismo y estudiar la vía de señalización activada por este compuesto. Mediante el uso de quelantes (BAPTA/AM y EDTA) verificamos que el GSH actúa aumentando la concentración citosólica de Ca2+. Asimismo, los resultados obtenidos a partir de los ensayos con EDTA, señalan que la entrada de Ca2+ a la célula es un mecanismo relevante para la liberación de desmonemes. A partir del uso de compuestos que modulan la actividad de receptores GPCR y de las proteínas involucradas en las cascadas de señalización canónicas, se demostró que el GSH provoca el ingreso de Ca2+ a través de canales VGCC tipo L, y su liberación desde depósitos intracelulares. Además, nuestros resultados sugieren que en la vía de acción de GSH está involucrada la activación de un GPCR, acoplado a proteína Gq, produciendo 1,4,5- inositol trifosfato (IP3) como segundo mensajero y la consiguiente salida de Ca2+ a través del receptor de IP3 (IP3R). Respecto de la entrada de Ca2+ mediada por VGCC tipo L, nuestros análisis bioinformáticos mostraron que el genoma de Hydra vulgaris predice la existencia de las diferentes subunidades de este tipo de canal, y que éstas presentan los motivos característicos conservados y un alto nivel de conservación respecto de los presentes en otros clados de metazoos, incluidos mamíferos. La descarga de cnidocistos es desencadenada por estímulos mecánicos que son sensados a nivel del cnidocil. Respecto de las proteínas involucradas en esta función, en Hydra sp., se ha demostrado que las células del ectodermo expresan diferentes proteínas mecano sensibles, entre ellas los canales Piezo. Con el objetivo de determinar si estos canales están involucrados en el proceso de descarga de cnidocistos, utilizamos un agonista específico de éstos (Jedi1), y tricloruro de gadolinio (GdCl3), un inhibidor inespecífico de canales mecano-sensibles. La cantidad de desmonemes disparados por efecto del agonista, se asemejó a los valores producidos por el GSH, mientras que en presencia de GdCl3, la descarga inducida por Jedi1 fue inhibida, sugiriendo la participación de canales Piezo en el proceso. El comportamiento alimentario de Hydra consiste en una serie de complejas secuencias comportamentales que incluyen a la descarga de cnidocistos como primer paso. Dicho comportamiento está regulado por diferentes mensajeros químicos, los cuales estimulan o inhiben las distintas etapas. Teniendo en consideración la importancia de regular la liberación de cnidocistos, y que los mensajeros estudiados en nuestro laboratorio (5-HT, AT y AST-C) participan en la regulación de otras de las etapas del comportamiento alimentario, evaluamos su rol en la descarga y sus interacciones a nivel funcional. En primer lugar, los experimentos fisiológicos mostraron que 5-HT induce la descarga de desmonemes. Posteriormente, se estudió la vía de señalización de 5-HT, para lo que utilizamos quelantes y compuestos inhibidores de GPCRs y de las proteínas involucradas en sus vías canónicas de transducción. A partir de los resultados obtenidos, proponemos que 5-HT estimula la descarga de desmonemes generando un aumento en la concentración citosólica de Ca2+ mediante la entrada de este ion desde el medio extracelular (que no involucra un VGCC tipo L), y su liberación desde el RE. Asimismo, en la vía activada participa un receptor GPCR (asociado a proteína Gq). Luego, se evaluó el rol de los neuropéptidos AT y AST-C sobre la descarga de desmonemes. Primeramente, análisis inmunohistoquímicos y microscopía de barrido laser confocal mostraron la colocalización de Actina-F y AT en los cnidocistos de los tentáculos, sugiriendo que el péptido podría estar involucrado en la regulación de la descarga. Además, mediante ensayos fisiológicos, observamos que AT incrementa la descarga de desmonemes, activando una vía de señalización que involucra la enzima fosfolipasa C (PLC) y la producción de IP3, la cual fue previamente caracterizada en la estimulación de la extrusión del hipostoma. Por otro lado, los experimentos fisiológicos también mostraron que AST-C por sí solo no induce descarga de desmonemes. Teniendo en cuenta que el comportamiento alimentario es regulado por varios mensajeros celulares actuando de manera coordinada, analizamos posibles interacciones funcionales entre un mensajero inhibitorio (i.e. AST-C), y los mensajeros estimuladores de la descarga (GSH, 5-HT y AT). Así la preincubación con AST-C, abolió la descarga inducida por AT, GSH y 5-HT. Estos resultados muestran que, al igual que para otros eventos del comportamiento alimentario (i.e. extrusión del hipostoma), mensajeros estimulatorios e inhibitorios podrían regular de forma coordinada la descarga de cnidocistos. Los aportes del presente trabajo incrementan el conocimiento acerca del mecanismo de descarga de cnidocistos en Hydra sp., proponiendo la relevancia de los estímulos químicos y las vías de señalización involucradas en este mecanismo. Además, proponemos que la descarga puede ser regulada por diferentes mensajeros químicos a través de vías de señalización canónicas asociadas a GPCR. Por último, y respecto a la recepción de estímulos mecánicos, proponemos la participación de los recientemente caracterizados canales mecano-sensibles Piezo en este mecanismo.
Phylum Cnidaria is considered the sister group of Bilateria. It evolved 700 million years ago, and it might be considered one of the earliest groups of Metazoa with a nervous system. This phylum is defined by the presence of a unique cell type, the cnidocyte. The cnidocyte presents a capsular structure with a long tubule inside called cnidocyst, which is involved in several functions such as feeding, adhesion, defense and construction of structures where to dwell. This cell presents a sensory structure, the cnidocil, which has mechano and chemoreceptive functions. The species of genus Hydra (Hydrozoa: Hydridae), described by Trembley in 1744, are part of the forty groups of freshwater cnidarians. This organism has proved to be a useful and prolific biological research model in several fields such as aging, neurobiology, regeneration, ecotoxicology, developmental biology, evolution and physiology. Hydra presents four different types of cnidocysts: stenoteles (penetrant), desmonemes (volvent), which participate in prey capture, and isorhizas (atrichous and holotrichous), related to defense and adhesion. The tentacles have the highest density of cnidocytes. They are organized forming battery cell complexes that include cnidocytes associated with a myoepithelial cell and neurons. To regulate cnidocyst discharge, the complex integrates mechanical and chemical stimuli. Also, due to the innervation of different complexes in the same tentacle, the discharge of a single cnidocyst induce and synchronize the discharge of distant ones. Each cnidocyst can only be discharged once, and because of that this mechanism needs to be finely regulated being activated only by signals corresponding to the presence of the prey. It is assumed that the discharge of cnidocysts requires the combination of chemical signals, that sensitizes the cnidocyst, and mechanical ones which activate the mechanoreceptive system of the cnidocil. One of these chemical signals is the reduced glutathione (GSH), a tripeptide present in all animal cells released by the wounded prey. It has been proved to be responsible of inducing the feeding behavior in Hydra, including the cnidocyst discharge. On the basis of these studies, it has been proposed that GSH (and other natural compounds such as amino acids, sugars and nucleotides) can modulate the thresholds to mechanical stimuli but not induce the discharge by themselves. Beyond the stimuli involved in the discharge, the ion calcium (Ca2+) plays an important role in this process, and it has been proved that the cnidocyst discharge is calcium dependent. Several works developed in cnidarians show that the reduction on the availability of Ca2+ in the culture medium causes a decrease of the discharge. Cells have two ways to increase the cytosolic calcium concentration: by the influx from the extracellular medium and/or by its liberation from intracellular deposits. In sea anemones, it has been shown that the influx of Ca2+ occurs through L-type voltage gated calcium channels (VGCC), and in Hydra it might be mediated by transient receptor potential (TRP) channels. On the other hand, several studies have shown that the increase of the cytosolic calcium concentration also depends on its release from intracellular stores, as the endoplasmic reticulum. To maintain homeostasis, metazoans require mechanisms of intercellular communication. These communication systems have evolved from a common ancestor and have been conserved throughout evolution. In our laboratory, we study physiological and evolutionary aspects of communication systems based on neuropeptides in animal models such as Triatoma infestans and Rhodnius prolixus (Insecta: Hemiptera) and the freshwater cnidarian Hydra sp. Specifically, we study the pleiotropic neuropeptides allatotropin (AT) and allatostatin-C (AST-C), which act as mioregulators in different physiological systems. In Hydra, AT and AST-C act as mioregulators during feeding behavior. AT treatment on hydroids causes extrusion of the hypostome (a structure that contains the mouth), resembling the response caused by the presence of food. AST-C induces changes on the body length and in tentacle behavior and produces peristaltic waves in the gastrovascular cavity. In addition to these effects, it antagonizes AT and the feeding response, diminishing hypostome extrusion. The ancestral position of cnidarians gives us a valuable opportunity to study how communication systems have arisen and evolved. AT and AST-C receptors show a high degree of homology with the orexin and somatostatin systems in vertebrates, indicating that these systems have an early evolutionary origin and despite they acquired new roles, they also maintain the original ones. In the same way, the serotonin (5-HT) system is also widely distributed in nature. 5-HT is a biogenic amine, known in mammals as a regulator of the contraction of blood vessels and the peristalsis of the digestive tube, but also associated with functions in the central nervous system. Despite its role has been studied in different groups of invertebrates (mollusks, nematodes, annelids, arthropods), being associated with modulation of feeding, locomotion, circadian rhythms, diuresis and learning, this system has been poorly studied in non-bilaterians. In cnidarians, it has been proposed that 5-HT is involved in muscle contraction, cnidocyst discharge and the metamorphosis of the larva planula. Preliminary experiments performed in our laboratory suggest that 5-HT has mioregulatory functions related to feeding behavior in Hydra sp. However, the signaling pathways that this messenger would be activating are still unknown. The present Doctoral Thesis has as main objective to analyze the mechanisms that regulate the discharge of cnidocysts in Hydra sp. We looked for understanding the mechanisms of response of the cnidocyte to chemical and mechanical stimuli through the exposition of hydroids to natural stimuli such as living prey and/or chemical signals released by them. Beyond that, we studied the regulation of the discharge by cellular messengers such as 5-HT, AT and AST-C, and the signaling pathways activated. First, we performed the diagnosis at the specie level of two colonies of hydras maintained in our laboratory. Indeed, we measured the length and width of both the body column and undischarged cnidocyst capsules. The analysis of different morphological features allowed us to identify our colonies as Hydra viridissima and Hydra vulgaris. Considering that both mechanical and chemical stimuli are necessary to induce discharge, we analyzed the relevance of chemical stimuli on the discharge. To do that, we exposed hydroids to different stimuli: living prey (mechanical and chemical signal), its homogenate, and GSH (both chemical signals). All stimuli tested increased the number of desmonemes discharged, suggesting that chemical compounds (acting without a mechanical stimulation) induce the discharge by themselves. Once confirmed its stimulatory effect, we choose GSH to analyze the relevance of Ca2+ in this process and the specific signaling pathway driving the mechanism of discharge. Using calcium chelators, we verified that the mechanism triggered by GSH is associated with cytosolic calcium concentration. Using drugs that inhibit proteins pertaining to canonical signaling pathways, including GPCRs, we showed that GSH causes the influx of Ca2+ via L-type VGCC, but also by its release from the endoplasmic reticulum. Moreover, our results suggest that GSH acts associated with a GPCR coupled to a Gq, which produces IP3 as second messenger, increasing cytosolic Ca2+ concentration through IP3R. Regarding the influx of Ca2+ through L-type VGCC, bioinformatic analysis showed that the genome of Hydra vulgaris predicts the existence of the different subunits of L-type VGCC, showing a high level of conservation when compared with other groups of Metazoa. The discharge of cnidocyst is produced also by mechanical stimuli sensed by the cnidocil. Regarding the proteins involved, in Hydra sp., it has been reported that ectoderm expresses proteins associated with the sensing of mechanical stimuli, such as Piezo protein, a recently characterized mechano-sensitive channel. We wondered if these channels are associated with the discharged of cnidocysts. As a first approach we assayed Jedi1, a specific agonist of Piezo proteins, and gadolinium chloride (GdCl3), an unspecific inhibitor of mechano-sensitive channels. The number of desmonemes discharged was increased by Jedi1, being similar to the effect caused by GSH, while in the presence of GdCl3 the discharge induced by Jedi1 was inhibited. These results suggest that Piezo proteins are also involved in the cnidocyst discharge. The feeding behavior of Hydra consists of a series of complex behavioral sequences that involved the cnidocyst discharge as the first step. This behavior is regulated by chemical messengers which stimulate or inhibit the different stages of the feeding behavior. Considering the relevance of the regulation of the discharge, and that the messengers studied in our laboratory (5-HT, AT and AST-C) have activity over other steps of the feeding response, we evaluated their role on the regulation of the cnidocyst discharge and their interactions on a functional level. First, physiological experiments showed 5-HT stimulates the discharge. Then, we studied the signaling pathway associated with this amine. To do that, we used ion chelators and inhibitors of GPCRs, and the proteins involved in the canonic pathways of this kind of receptors. The results obtained showed that 5-HT acts increasing cytosolic calcium concentration by means of flux of this ion from the extracellular medium (not L-type VGCC involved) and its release from endoplasmic reticulum. The activated pathway would involve a GPCR coupled to a Gq protein. Furthermore, we evaluated the activity of the other two messengers (i.e. AT and AST-C) on the desmoneme discharge. To determine if AT is present in the cnidocysts, we performed an immunohistochemical analysis. The images obtained by means of confocal laser microscopy showed the colocalization of F-actin and AT in the cnidocysts of tentacles, suggesting that the peptide could be involved in the regulation of the cnidocyst discharge. By performing physiological assays, we observed that AT increases desmoneme discharge and it would be activating a signaling pathway involving the enzyme PLC and the synthesis of IP3. This signaling pathway was previously characterized by our lab on the process of hypostome extrusion. On the other hand, AST-C assays showed that the peptide by its own does not stimulate the discharge. Taking into consideration that the feeding behavior is regulated by several chemical messengers, we studied possible functional interactions between the inhibitory messenger AST-C and the stimulatory messengers of the discharge (GSH, 5-HT and AT). Using a protocol that included pre-incubation with AST-C, we observed that this peptide inhibited the desmoneme discharge induced by GSH, 5-HT and AT. These results showed that stimulatory and inhibitory messengers could be regulating the cnidocyst discharge in a coordinated way. The body of evidence presented in this work increases the knowledge we have about the cnidocyst discharge in Hydra sp., proposing the relevance of chemical stimuli and the signaling pathways involved in this mechanism. Also, we demonstrate that the discharge could be regulated by different chemical messengers which activate canonical signaling pathways associated with GPCRs. Finally, regarding the reception of mechanical stimuli, we proposed the involvement of the recently characterized Piezo proteins on the discharge.
Doctor en Ciencias Naturales
Universidad Nacional de La Plata
Facultad de Ciencias Naturales y Museo
Materia: Ciencias Naturales
Hydra
Descarga de cnidocistos
Mensajeros químicos
Allatotropina
Allatostatina-C
Serotonina
GPCR
Cnidaria
Glutatión reducido (GSH)
Evolución
Nivel de accesibilidad: acceso abierto
Condiciones de uso: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
Repositorio
Institución: Universidad Nacional de La Plata
OAI Identificador: oai:sedici.unlp.edu.ar:10915/195374

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Las especies del género Hydra (Hydrozoa: Hydridae), descrito por Trembley en 1744, forman parte de las 40 especies dulceacuícolas de cnidarios. Este organismo, ha resultado ser un eficiente y exitoso modelo biológico para el desarrollo de numerosas investigaciones, incluyendo estudios de envejecimiento, neurobiología, regeneración, ecotoxicología, biología del desarrollo, evolución y fisiología. Hydra posee cuatro tipos de cnidocistos: estenoteles, desmonemes, atricos isorrizas y holotricos isorrizas, de los cuales los dos primeros participan en la captura de presas, mientras que el tercer y cuarto tipo están involucrados en la adhesión al sustrato y la defensa, respectivamente. Los cnidocistos se ubican principalmente a nivel de los tentáculos, y se organizan formando los denominados “complejos de batería celular”. Cada complejo está formado por cnidocitos que se asocian a una célula epiteliomuscular y neuronas, e integra señales mecánicas y químicas del entorno, las cuales representan los estímulos que inducen su descarga. Además, dada la asociación de las baterías con células nerviosas, la estimulación de un cnidocisto causa también la descarga de otros ubicados a cierta distancia. Dado que la descarga del cnidocisto es un proceso irreversible, resulta fundamental que este mecanismo sea finamente regulado y se active sólo bajo las condiciones adecuadas. Se ha postulado que la descarga de los cnidocistos asociados a la captura de presas requiere de la presencia conjunta de estímulos químicos, encargados de sensibilizar al cnidocisto, y de estímulos mecánicos, que activan al sistema mecanorreceptor en el cnidocil. Dentro de las señales químicas que recibe el cnidocito se encuentra el glutatión reducido (GSH), un tripéptido contenido en todas las células animales, que es liberado cuando la presa es lastimada. Dicho compuesto ha demostrado estimular el comportamiento alimentario de Hydra, incluyendo la descarga de cnidocistos. A partir de estos estudios se ha propuesto que el GSH sensibiliza a la célula para reaccionar frente a un estímulo mecánico, pero no causaría la descarga por sí mismo. Más allá de los estímulos involucrados, se ha demostrado que la descarga es un proceso dependiente de calcio (Ca2+). Estudios realizados en hidrozoos y antozoos demuestran que la disminución de los niveles de Ca2+ extracelular inhibe la descarga. Las células disponen de dos mecanismos para aumentar la concentración citosólica de este ion: la entrada desde el medio extracelular y/o la liberación desde depósitos intracelulares. Respecto de los mecanismos relacionados con la descarga de cnidocistos, se ha observado en anémonas que la entrada de Ca2+ ocurre a través de canales dependientes de voltaje (VGCC) tipo L, mientras que, en Hydra sp., se propuso que el ingreso de calcio ocurre a través de un tipo de receptor de potencial transitorio (TRP). Además de su ingreso desde el medio extracelular, varios estudios muestran que el aumento de la concentración del Ca2+ citosólico depende además de su liberación desde el retículo endoplásmico (RE). Para mantener la homeostasis, los metazoos necesitan mecanismos de comunicación intercelular. Estos mecanismos de comunicación han evolucionado a partir de un ancestro común y se han conservado a lo largo de la evolución. En nuestro laboratorio estudiamos aspectos fisiológicos y evolutivos de sistemas de comunicación basados en neuropéptidos en modelos animales de insectos hemípteros (Triatoma infestans y Rhodnius prolixus) y el cnidario de agua dulce Hydra sp. Específicamente estudiamos los neuropéptidos pleiotrópicos allatotropina (AT) y allatostatina-C (AST-C), los cuales, entre otras funciones, son reguladores de la contracción muscular en diferentes sistemas fisiológicos. En Hydra, AT y AST-C actúan como mioreguladores durante el comportamiento alimentario. El tratamiento con AT provoca un incremento en la longitud del hipostoma (estructura donde se ubica la boca), mimetizando el efecto desencadenado por la presencia de alimento. Por su parte, AST-C tiene efecto en el largo del cuerpo, aumenta la actividad de los tentáculos y la actividad contráctil de la cavidad gastrovascular donde genera ondas peristálticas, similares a las desencadenadas luego de la ingesta. Además, este neuropéptido antagoniza el efecto de AT y del alimento sobre la extrusión del hipostoma. La posición basal de los cnidarios en el árbol filogenético nos provee una valiosa oportunidad para conocer el origen y la evolución de los sistemas de comunicación. Los receptores de AT y AST-C presentan un alto grado de homología con los de orexina y somatostatina en vertebrados, lo que muestra que estos sistemas surgieron tempranamente en la evolución, conservando los roles basales y adquiriendo nuevos. De igual forma, el sistema de serotonina (5-HT) es también un sistema ancestral y ampliamente distribuido en la naturaleza. 5-HT es una amina biogénica, conocida en mamíferos por su papel en la regulación de la contracción de la musculatura lisa vascular y la peristalsis del tubo digestivo, como así también, a nivel del sistema nervioso central en donde cumple distintas funciones. En invertebrados (moluscos, nematodes, anélidos, artrópodos), también se ha demostrado que interviene en funciones como la modulación de la alimentación, la locomoción, los ritmos circadianos, la diuresis y el aprendizaje, sin embargo, este sistema ha sido poco estudiado en metazoos basales. En cnidarios, se ha propuesto la participación de serotonina en la regulación de procesos como la contracción muscular, la descarga de cnidocistos y la metamorfosis de la larva plánula. Experimentos preliminares de nuestro laboratorio, sugieren que serotonina posee funciones mioregulatorias relacionadas al comportamiento alimentario en Hydra sp. Sin embargo, las vías de señalización que activaría este mensajero aún son desconocidas. El presente trabajo de Tesis Doctoral tiene como objetivo principal el análisis de los mecanismos que regulan la liberación de cnidocistos en Hydra sp. Se buscó comprender la respuesta frente a estímulos químicos y mecánicos a través de la exposición a estímulos naturales, como las presas vivas y/o señales químicas liberadas por estas al ser heridas. Estudiamos su regulación por mensajeros celulares como 5-HT, AT y AST-C y las correspondientes vías de señalización activadas. En primera instancia, se realizó la diagnosis a nivel específico de las dos colonias de hidras establecidas en nuestro laboratorio. La toma y posterior análisis de diferentes caracteres morfológicos permitió identificar a nuestras colonias como Hydra viridissima, e Hydra vulgaris. Con el objetivo de analizar la relevancia de los estímulos químicos sobre la descarga de cnidocistos, y teniendo en cuenta que se asume que es necesaria la exposición a estímulos químicos y mecánicos simultáneamente para activar este mecanismo, expusimos hidras a tres condiciones: i.e. larvas vivas de Artemia salina (estimulo mecánico y químico), homogenato de larvas de artemias y GSH (ambos estímulos exclusivamente químicos). Las tres condiciones generaron un aumento similar en la cantidad de desmonemes descargados, demostrando que, al menos en nuestro sistema de estudio, el estímulo químico por sí solo es suficiente para inducir la descarga. Una vez confirmado su efecto estimulatorio, elegimos al GSH para corroborar la dependencia de Ca2+ de este mecanismo y estudiar la vía de señalización activada por este compuesto. Mediante el uso de quelantes (BAPTA/AM y EDTA) verificamos que el GSH actúa aumentando la concentración citosólica de Ca2+. Asimismo, los resultados obtenidos a partir de los ensayos con EDTA, señalan que la entrada de Ca2+ a la célula es un mecanismo relevante para la liberación de desmonemes. A partir del uso de compuestos que modulan la actividad de receptores GPCR y de las proteínas involucradas en las cascadas de señalización canónicas, se demostró que el GSH provoca el ingreso de Ca2+ a través de canales VGCC tipo L, y su liberación desde depósitos intracelulares. Además, nuestros resultados sugieren que en la vía de acción de GSH está involucrada la activación de un GPCR, acoplado a proteína Gq, produciendo 1,4,5- inositol trifosfato (IP3) como segundo mensajero y la consiguiente salida de Ca2+ a través del receptor de IP3 (IP3R). Respecto de la entrada de Ca2+ mediada por VGCC tipo L, nuestros análisis bioinformáticos mostraron que el genoma de Hydra vulgaris predice la existencia de las diferentes subunidades de este tipo de canal, y que éstas presentan los motivos característicos conservados y un alto nivel de conservación respecto de los presentes en otros clados de metazoos, incluidos mamíferos. La descarga de cnidocistos es desencadenada por estímulos mecánicos que son sensados a nivel del cnidocil. Respecto de las proteínas involucradas en esta función, en Hydra sp., se ha demostrado que las células del ectodermo expresan diferentes proteínas mecano sensibles, entre ellas los canales Piezo. Con el objetivo de determinar si estos canales están involucrados en el proceso de descarga de cnidocistos, utilizamos un agonista específico de éstos (Jedi1), y tricloruro de gadolinio (GdCl3), un inhibidor inespecífico de canales mecano-sensibles. La cantidad de desmonemes disparados por efecto del agonista, se asemejó a los valores producidos por el GSH, mientras que en presencia de GdCl3, la descarga inducida por Jedi1 fue inhibida, sugiriendo la participación de canales Piezo en el proceso. El comportamiento alimentario de Hydra consiste en una serie de complejas secuencias comportamentales que incluyen a la descarga de cnidocistos como primer paso. Dicho comportamiento está regulado por diferentes mensajeros químicos, los cuales estimulan o inhiben las distintas etapas. Teniendo en consideración la importancia de regular la liberación de cnidocistos, y que los mensajeros estudiados en nuestro laboratorio (5-HT, AT y AST-C) participan en la regulación de otras de las etapas del comportamiento alimentario, evaluamos su rol en la descarga y sus interacciones a nivel funcional. En primer lugar, los experimentos fisiológicos mostraron que 5-HT induce la descarga de desmonemes. Posteriormente, se estudió la vía de señalización de 5-HT, para lo que utilizamos quelantes y compuestos inhibidores de GPCRs y de las proteínas involucradas en sus vías canónicas de transducción. A partir de los resultados obtenidos, proponemos que 5-HT estimula la descarga de desmonemes generando un aumento en la concentración citosólica de Ca2+ mediante la entrada de este ion desde el medio extracelular (que no involucra un VGCC tipo L), y su liberación desde el RE. Asimismo, en la vía activada participa un receptor GPCR (asociado a proteína Gq). Luego, se evaluó el rol de los neuropéptidos AT y AST-C sobre la descarga de desmonemes. Primeramente, análisis inmunohistoquímicos y microscopía de barrido laser confocal mostraron la colocalización de Actina-F y AT en los cnidocistos de los tentáculos, sugiriendo que el péptido podría estar involucrado en la regulación de la descarga. Además, mediante ensayos fisiológicos, observamos que AT incrementa la descarga de desmonemes, activando una vía de señalización que involucra la enzima fosfolipasa C (PLC) y la producción de IP3, la cual fue previamente caracterizada en la estimulación de la extrusión del hipostoma. Por otro lado, los experimentos fisiológicos también mostraron que AST-C por sí solo no induce descarga de desmonemes. Teniendo en cuenta que el comportamiento alimentario es regulado por varios mensajeros celulares actuando de manera coordinada, analizamos posibles interacciones funcionales entre un mensajero inhibitorio (i.e. AST-C), y los mensajeros estimuladores de la descarga (GSH, 5-HT y AT). Así la preincubación con AST-C, abolió la descarga inducida por AT, GSH y 5-HT. Estos resultados muestran que, al igual que para otros eventos del comportamiento alimentario (i.e. extrusión del hipostoma), mensajeros estimulatorios e inhibitorios podrían regular de forma coordinada la descarga de cnidocistos. Los aportes del presente trabajo incrementan el conocimiento acerca del mecanismo de descarga de cnidocistos en Hydra sp., proponiendo la relevancia de los estímulos químicos y las vías de señalización involucradas en este mecanismo. Además, proponemos que la descarga puede ser regulada por diferentes mensajeros químicos a través de vías de señalización canónicas asociadas a GPCR. Por último, y respecto a la recepción de estímulos mecánicos, proponemos la participación de los recientemente caracterizados canales mecano-sensibles Piezo en este mecanismo.Phylum Cnidaria is considered the sister group of Bilateria. It evolved 700 million years ago, and it might be considered one of the earliest groups of Metazoa with a nervous system. This phylum is defined by the presence of a unique cell type, the cnidocyte. The cnidocyte presents a capsular structure with a long tubule inside called cnidocyst, which is involved in several functions such as feeding, adhesion, defense and construction of structures where to dwell. This cell presents a sensory structure, the cnidocil, which has mechano and chemoreceptive functions. The species of genus Hydra (Hydrozoa: Hydridae), described by Trembley in 1744, are part of the forty groups of freshwater cnidarians. This organism has proved to be a useful and prolific biological research model in several fields such as aging, neurobiology, regeneration, ecotoxicology, developmental biology, evolution and physiology. Hydra presents four different types of cnidocysts: stenoteles (penetrant), desmonemes (volvent), which participate in prey capture, and isorhizas (atrichous and holotrichous), related to defense and adhesion. The tentacles have the highest density of cnidocytes. They are organized forming battery cell complexes that include cnidocytes associated with a myoepithelial cell and neurons. To regulate cnidocyst discharge, the complex integrates mechanical and chemical stimuli. Also, due to the innervation of different complexes in the same tentacle, the discharge of a single cnidocyst induce and synchronize the discharge of distant ones. Each cnidocyst can only be discharged once, and because of that this mechanism needs to be finely regulated being activated only by signals corresponding to the presence of the prey. It is assumed that the discharge of cnidocysts requires the combination of chemical signals, that sensitizes the cnidocyst, and mechanical ones which activate the mechanoreceptive system of the cnidocil. One of these chemical signals is the reduced glutathione (GSH), a tripeptide present in all animal cells released by the wounded prey. It has been proved to be responsible of inducing the feeding behavior in Hydra, including the cnidocyst discharge. On the basis of these studies, it has been proposed that GSH (and other natural compounds such as amino acids, sugars and nucleotides) can modulate the thresholds to mechanical stimuli but not induce the discharge by themselves. Beyond the stimuli involved in the discharge, the ion calcium (Ca2+) plays an important role in this process, and it has been proved that the cnidocyst discharge is calcium dependent. Several works developed in cnidarians show that the reduction on the availability of Ca2+ in the culture medium causes a decrease of the discharge. Cells have two ways to increase the cytosolic calcium concentration: by the influx from the extracellular medium and/or by its liberation from intracellular deposits. In sea anemones, it has been shown that the influx of Ca2+ occurs through L-type voltage gated calcium channels (VGCC), and in Hydra it might be mediated by transient receptor potential (TRP) channels. On the other hand, several studies have shown that the increase of the cytosolic calcium concentration also depends on its release from intracellular stores, as the endoplasmic reticulum. To maintain homeostasis, metazoans require mechanisms of intercellular communication. These communication systems have evolved from a common ancestor and have been conserved throughout evolution. In our laboratory, we study physiological and evolutionary aspects of communication systems based on neuropeptides in animal models such as Triatoma infestans and Rhodnius prolixus (Insecta: Hemiptera) and the freshwater cnidarian Hydra sp. Specifically, we study the pleiotropic neuropeptides allatotropin (AT) and allatostatin-C (AST-C), which act as mioregulators in different physiological systems. In Hydra, AT and AST-C act as mioregulators during feeding behavior. AT treatment on hydroids causes extrusion of the hypostome (a structure that contains the mouth), resembling the response caused by the presence of food. AST-C induces changes on the body length and in tentacle behavior and produces peristaltic waves in the gastrovascular cavity. In addition to these effects, it antagonizes AT and the feeding response, diminishing hypostome extrusion. The ancestral position of cnidarians gives us a valuable opportunity to study how communication systems have arisen and evolved. AT and AST-C receptors show a high degree of homology with the orexin and somatostatin systems in vertebrates, indicating that these systems have an early evolutionary origin and despite they acquired new roles, they also maintain the original ones. In the same way, the serotonin (5-HT) system is also widely distributed in nature. 5-HT is a biogenic amine, known in mammals as a regulator of the contraction of blood vessels and the peristalsis of the digestive tube, but also associated with functions in the central nervous system. Despite its role has been studied in different groups of invertebrates (mollusks, nematodes, annelids, arthropods), being associated with modulation of feeding, locomotion, circadian rhythms, diuresis and learning, this system has been poorly studied in non-bilaterians. In cnidarians, it has been proposed that 5-HT is involved in muscle contraction, cnidocyst discharge and the metamorphosis of the larva planula. Preliminary experiments performed in our laboratory suggest that 5-HT has mioregulatory functions related to feeding behavior in Hydra sp. However, the signaling pathways that this messenger would be activating are still unknown. The present Doctoral Thesis has as main objective to analyze the mechanisms that regulate the discharge of cnidocysts in Hydra sp. We looked for understanding the mechanisms of response of the cnidocyte to chemical and mechanical stimuli through the exposition of hydroids to natural stimuli such as living prey and/or chemical signals released by them. Beyond that, we studied the regulation of the discharge by cellular messengers such as 5-HT, AT and AST-C, and the signaling pathways activated. First, we performed the diagnosis at the specie level of two colonies of hydras maintained in our laboratory. Indeed, we measured the length and width of both the body column and undischarged cnidocyst capsules. The analysis of different morphological features allowed us to identify our colonies as Hydra viridissima and Hydra vulgaris. Considering that both mechanical and chemical stimuli are necessary to induce discharge, we analyzed the relevance of chemical stimuli on the discharge. To do that, we exposed hydroids to different stimuli: living prey (mechanical and chemical signal), its homogenate, and GSH (both chemical signals). All stimuli tested increased the number of desmonemes discharged, suggesting that chemical compounds (acting without a mechanical stimulation) induce the discharge by themselves. Once confirmed its stimulatory effect, we choose GSH to analyze the relevance of Ca2+ in this process and the specific signaling pathway driving the mechanism of discharge. Using calcium chelators, we verified that the mechanism triggered by GSH is associated with cytosolic calcium concentration. Using drugs that inhibit proteins pertaining to canonical signaling pathways, including GPCRs, we showed that GSH causes the influx of Ca2+ via L-type VGCC, but also by its release from the endoplasmic reticulum. Moreover, our results suggest that GSH acts associated with a GPCR coupled to a Gq, which produces IP3 as second messenger, increasing cytosolic Ca2+ concentration through IP3R. Regarding the influx of Ca2+ through L-type VGCC, bioinformatic analysis showed that the genome of Hydra vulgaris predicts the existence of the different subunits of L-type VGCC, showing a high level of conservation when compared with other groups of Metazoa. The discharge of cnidocyst is produced also by mechanical stimuli sensed by the cnidocil. Regarding the proteins involved, in Hydra sp., it has been reported that ectoderm expresses proteins associated with the sensing of mechanical stimuli, such as Piezo protein, a recently characterized mechano-sensitive channel. We wondered if these channels are associated with the discharged of cnidocysts. As a first approach we assayed Jedi1, a specific agonist of Piezo proteins, and gadolinium chloride (GdCl3), an unspecific inhibitor of mechano-sensitive channels. The number of desmonemes discharged was increased by Jedi1, being similar to the effect caused by GSH, while in the presence of GdCl3 the discharge induced by Jedi1 was inhibited. These results suggest that Piezo proteins are also involved in the cnidocyst discharge. The feeding behavior of Hydra consists of a series of complex behavioral sequences that involved the cnidocyst discharge as the first step. This behavior is regulated by chemical messengers which stimulate or inhibit the different stages of the feeding behavior. Considering the relevance of the regulation of the discharge, and that the messengers studied in our laboratory (5-HT, AT and AST-C) have activity over other steps of the feeding response, we evaluated their role on the regulation of the cnidocyst discharge and their interactions on a functional level. First, physiological experiments showed 5-HT stimulates the discharge. Then, we studied the signaling pathway associated with this amine. To do that, we used ion chelators and inhibitors of GPCRs, and the proteins involved in the canonic pathways of this kind of receptors. The results obtained showed that 5-HT acts increasing cytosolic calcium concentration by means of flux of this ion from the extracellular medium (not L-type VGCC involved) and its release from endoplasmic reticulum. The activated pathway would involve a GPCR coupled to a Gq protein. Furthermore, we evaluated the activity of the other two messengers (i.e. AT and AST-C) on the desmoneme discharge. To determine if AT is present in the cnidocysts, we performed an immunohistochemical analysis. The images obtained by means of confocal laser microscopy showed the colocalization of F-actin and AT in the cnidocysts of tentacles, suggesting that the peptide could be involved in the regulation of the cnidocyst discharge. By performing physiological assays, we observed that AT increases desmoneme discharge and it would be activating a signaling pathway involving the enzyme PLC and the synthesis of IP3. This signaling pathway was previously characterized by our lab on the process of hypostome extrusion. On the other hand, AST-C assays showed that the peptide by its own does not stimulate the discharge. Taking into consideration that the feeding behavior is regulated by several chemical messengers, we studied possible functional interactions between the inhibitory messenger AST-C and the stimulatory messengers of the discharge (GSH, 5-HT and AT). Using a protocol that included pre-incubation with AST-C, we observed that this peptide inhibited the desmoneme discharge induced by GSH, 5-HT and AT. These results showed that stimulatory and inhibitory messengers could be regulating the cnidocyst discharge in a coordinated way. The body of evidence presented in this work increases the knowledge we have about the cnidocyst discharge in Hydra sp., proposing the relevance of chemical stimuli and the signaling pathways involved in this mechanism. Also, we demonstrate that the discharge could be regulated by different chemical messengers which activate canonical signaling pathways associated with GPCRs. Finally, regarding the reception of mechanical stimuli, we proposed the involvement of the recently characterized Piezo proteins on the discharge.Doctor en Ciencias NaturalesUniversidad Nacional de La PlataFacultad de Ciencias Naturales y MuseoRonderos, Jorge RafaelAlzugaray, María Eugenia2026-05-28info:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/acceptedVersionTesis de doctoradohttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06info:ar-repo/semantics/tesisDoctoralapplication/pdfhttp://sedici.unlp.edu.ar/handle/10915/195374https://doi.org/10.35537/10915/195374spainfo:eu-repo/semantics/openAccesshttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International (CC BY-NC-ND 4.0)reponame:SEDICI (UNLP)instname:Universidad Nacional de La Platainstacron:UNLP2026-06-23T11:17:02Zoai:sedici.unlp.edu.ar:10915/195374Institucionalhttp://sedici.unlp.edu.ar/Universidad públicaNo correspondehttp://sedici.unlp.edu.ar/oai/snrdalira@sedici.unlp.edu.arArgentinaNo correspondeNo correspondeNo correspondeopendoar:13292026-06-23 11:17:02.685SEDICI (UNLP) - Universidad Nacional de La Platafalse
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dc.description.none.fl_txt_mv	El phylum Cnidaria es considerado el grupo hermano de Bilateria. El origen de los cnidarios se remonta a 700 millones de años atrás y representa uno de los grupos más ancestrales de metazoos con sistema nervioso. La sinapomorfía que reúne a los miembros de este clado es la presencia de un tipo celular especializado conocido como cnidocito. El cnidocito contiene una estructura capsular con un filamento enrollado en su interior, el cnidocisto, el cual cumple funciones como defensa, captura de presas, adhesión al sustrato y construcción de estructuras en las que habitar. Además, desde la membrana de la célula, se proyecta el cnidocil, un complejo mecano-sensitivo cuya activación provoca la descarga del cnidocisto. Las especies del género Hydra (Hydrozoa: Hydridae), descrito por Trembley en 1744, forman parte de las 40 especies dulceacuícolas de cnidarios. Este organismo, ha resultado ser un eficiente y exitoso modelo biológico para el desarrollo de numerosas investigaciones, incluyendo estudios de envejecimiento, neurobiología, regeneración, ecotoxicología, biología del desarrollo, evolución y fisiología. Hydra posee cuatro tipos de cnidocistos: estenoteles, desmonemes, atricos isorrizas y holotricos isorrizas, de los cuales los dos primeros participan en la captura de presas, mientras que el tercer y cuarto tipo están involucrados en la adhesión al sustrato y la defensa, respectivamente. Los cnidocistos se ubican principalmente a nivel de los tentáculos, y se organizan formando los denominados “complejos de batería celular”. Cada complejo está formado por cnidocitos que se asocian a una célula epiteliomuscular y neuronas, e integra señales mecánicas y químicas del entorno, las cuales representan los estímulos que inducen su descarga. Además, dada la asociación de las baterías con células nerviosas, la estimulación de un cnidocisto causa también la descarga de otros ubicados a cierta distancia. Dado que la descarga del cnidocisto es un proceso irreversible, resulta fundamental que este mecanismo sea finamente regulado y se active sólo bajo las condiciones adecuadas. Se ha postulado que la descarga de los cnidocistos asociados a la captura de presas requiere de la presencia conjunta de estímulos químicos, encargados de sensibilizar al cnidocisto, y de estímulos mecánicos, que activan al sistema mecanorreceptor en el cnidocil. Dentro de las señales químicas que recibe el cnidocito se encuentra el glutatión reducido (GSH), un tripéptido contenido en todas las células animales, que es liberado cuando la presa es lastimada. Dicho compuesto ha demostrado estimular el comportamiento alimentario de Hydra, incluyendo la descarga de cnidocistos. A partir de estos estudios se ha propuesto que el GSH sensibiliza a la célula para reaccionar frente a un estímulo mecánico, pero no causaría la descarga por sí mismo. Más allá de los estímulos involucrados, se ha demostrado que la descarga es un proceso dependiente de calcio (Ca2+). Estudios realizados en hidrozoos y antozoos demuestran que la disminución de los niveles de Ca2+ extracelular inhibe la descarga. Las células disponen de dos mecanismos para aumentar la concentración citosólica de este ion: la entrada desde el medio extracelular y/o la liberación desde depósitos intracelulares. Respecto de los mecanismos relacionados con la descarga de cnidocistos, se ha observado en anémonas que la entrada de Ca2+ ocurre a través de canales dependientes de voltaje (VGCC) tipo L, mientras que, en Hydra sp., se propuso que el ingreso de calcio ocurre a través de un tipo de receptor de potencial transitorio (TRP). Además de su ingreso desde el medio extracelular, varios estudios muestran que el aumento de la concentración del Ca2+ citosólico depende además de su liberación desde el retículo endoplásmico (RE). Para mantener la homeostasis, los metazoos necesitan mecanismos de comunicación intercelular. Estos mecanismos de comunicación han evolucionado a partir de un ancestro común y se han conservado a lo largo de la evolución. En nuestro laboratorio estudiamos aspectos fisiológicos y evolutivos de sistemas de comunicación basados en neuropéptidos en modelos animales de insectos hemípteros (Triatoma infestans y Rhodnius prolixus) y el cnidario de agua dulce Hydra sp. Específicamente estudiamos los neuropéptidos pleiotrópicos allatotropina (AT) y allatostatina-C (AST-C), los cuales, entre otras funciones, son reguladores de la contracción muscular en diferentes sistemas fisiológicos. En Hydra, AT y AST-C actúan como mioreguladores durante el comportamiento alimentario. El tratamiento con AT provoca un incremento en la longitud del hipostoma (estructura donde se ubica la boca), mimetizando el efecto desencadenado por la presencia de alimento. Por su parte, AST-C tiene efecto en el largo del cuerpo, aumenta la actividad de los tentáculos y la actividad contráctil de la cavidad gastrovascular donde genera ondas peristálticas, similares a las desencadenadas luego de la ingesta. Además, este neuropéptido antagoniza el efecto de AT y del alimento sobre la extrusión del hipostoma. La posición basal de los cnidarios en el árbol filogenético nos provee una valiosa oportunidad para conocer el origen y la evolución de los sistemas de comunicación. Los receptores de AT y AST-C presentan un alto grado de homología con los de orexina y somatostatina en vertebrados, lo que muestra que estos sistemas surgieron tempranamente en la evolución, conservando los roles basales y adquiriendo nuevos. De igual forma, el sistema de serotonina (5-HT) es también un sistema ancestral y ampliamente distribuido en la naturaleza. 5-HT es una amina biogénica, conocida en mamíferos por su papel en la regulación de la contracción de la musculatura lisa vascular y la peristalsis del tubo digestivo, como así también, a nivel del sistema nervioso central en donde cumple distintas funciones. En invertebrados (moluscos, nematodes, anélidos, artrópodos), también se ha demostrado que interviene en funciones como la modulación de la alimentación, la locomoción, los ritmos circadianos, la diuresis y el aprendizaje, sin embargo, este sistema ha sido poco estudiado en metazoos basales. En cnidarios, se ha propuesto la participación de serotonina en la regulación de procesos como la contracción muscular, la descarga de cnidocistos y la metamorfosis de la larva plánula. Experimentos preliminares de nuestro laboratorio, sugieren que serotonina posee funciones mioregulatorias relacionadas al comportamiento alimentario en Hydra sp. Sin embargo, las vías de señalización que activaría este mensajero aún son desconocidas. El presente trabajo de Tesis Doctoral tiene como objetivo principal el análisis de los mecanismos que regulan la liberación de cnidocistos en Hydra sp. Se buscó comprender la respuesta frente a estímulos químicos y mecánicos a través de la exposición a estímulos naturales, como las presas vivas y/o señales químicas liberadas por estas al ser heridas. Estudiamos su regulación por mensajeros celulares como 5-HT, AT y AST-C y las correspondientes vías de señalización activadas. En primera instancia, se realizó la diagnosis a nivel específico de las dos colonias de hidras establecidas en nuestro laboratorio. La toma y posterior análisis de diferentes caracteres morfológicos permitió identificar a nuestras colonias como Hydra viridissima, e Hydra vulgaris. Con el objetivo de analizar la relevancia de los estímulos químicos sobre la descarga de cnidocistos, y teniendo en cuenta que se asume que es necesaria la exposición a estímulos químicos y mecánicos simultáneamente para activar este mecanismo, expusimos hidras a tres condiciones: i.e. larvas vivas de Artemia salina (estimulo mecánico y químico), homogenato de larvas de artemias y GSH (ambos estímulos exclusivamente químicos). Las tres condiciones generaron un aumento similar en la cantidad de desmonemes descargados, demostrando que, al menos en nuestro sistema de estudio, el estímulo químico por sí solo es suficiente para inducir la descarga. Una vez confirmado su efecto estimulatorio, elegimos al GSH para corroborar la dependencia de Ca2+ de este mecanismo y estudiar la vía de señalización activada por este compuesto. Mediante el uso de quelantes (BAPTA/AM y EDTA) verificamos que el GSH actúa aumentando la concentración citosólica de Ca2+. Asimismo, los resultados obtenidos a partir de los ensayos con EDTA, señalan que la entrada de Ca2+ a la célula es un mecanismo relevante para la liberación de desmonemes. A partir del uso de compuestos que modulan la actividad de receptores GPCR y de las proteínas involucradas en las cascadas de señalización canónicas, se demostró que el GSH provoca el ingreso de Ca2+ a través de canales VGCC tipo L, y su liberación desde depósitos intracelulares. Además, nuestros resultados sugieren que en la vía de acción de GSH está involucrada la activación de un GPCR, acoplado a proteína Gq, produciendo 1,4,5- inositol trifosfato (IP3) como segundo mensajero y la consiguiente salida de Ca2+ a través del receptor de IP3 (IP3R). Respecto de la entrada de Ca2+ mediada por VGCC tipo L, nuestros análisis bioinformáticos mostraron que el genoma de Hydra vulgaris predice la existencia de las diferentes subunidades de este tipo de canal, y que éstas presentan los motivos característicos conservados y un alto nivel de conservación respecto de los presentes en otros clados de metazoos, incluidos mamíferos. La descarga de cnidocistos es desencadenada por estímulos mecánicos que son sensados a nivel del cnidocil. Respecto de las proteínas involucradas en esta función, en Hydra sp., se ha demostrado que las células del ectodermo expresan diferentes proteínas mecano sensibles, entre ellas los canales Piezo. Con el objetivo de determinar si estos canales están involucrados en el proceso de descarga de cnidocistos, utilizamos un agonista específico de éstos (Jedi1), y tricloruro de gadolinio (GdCl3), un inhibidor inespecífico de canales mecano-sensibles. La cantidad de desmonemes disparados por efecto del agonista, se asemejó a los valores producidos por el GSH, mientras que en presencia de GdCl3, la descarga inducida por Jedi1 fue inhibida, sugiriendo la participación de canales Piezo en el proceso. El comportamiento alimentario de Hydra consiste en una serie de complejas secuencias comportamentales que incluyen a la descarga de cnidocistos como primer paso. Dicho comportamiento está regulado por diferentes mensajeros químicos, los cuales estimulan o inhiben las distintas etapas. Teniendo en consideración la importancia de regular la liberación de cnidocistos, y que los mensajeros estudiados en nuestro laboratorio (5-HT, AT y AST-C) participan en la regulación de otras de las etapas del comportamiento alimentario, evaluamos su rol en la descarga y sus interacciones a nivel funcional. En primer lugar, los experimentos fisiológicos mostraron que 5-HT induce la descarga de desmonemes. Posteriormente, se estudió la vía de señalización de 5-HT, para lo que utilizamos quelantes y compuestos inhibidores de GPCRs y de las proteínas involucradas en sus vías canónicas de transducción. A partir de los resultados obtenidos, proponemos que 5-HT estimula la descarga de desmonemes generando un aumento en la concentración citosólica de Ca2+ mediante la entrada de este ion desde el medio extracelular (que no involucra un VGCC tipo L), y su liberación desde el RE. Asimismo, en la vía activada participa un receptor GPCR (asociado a proteína Gq). Luego, se evaluó el rol de los neuropéptidos AT y AST-C sobre la descarga de desmonemes. Primeramente, análisis inmunohistoquímicos y microscopía de barrido laser confocal mostraron la colocalización de Actina-F y AT en los cnidocistos de los tentáculos, sugiriendo que el péptido podría estar involucrado en la regulación de la descarga. Además, mediante ensayos fisiológicos, observamos que AT incrementa la descarga de desmonemes, activando una vía de señalización que involucra la enzima fosfolipasa C (PLC) y la producción de IP3, la cual fue previamente caracterizada en la estimulación de la extrusión del hipostoma. Por otro lado, los experimentos fisiológicos también mostraron que AST-C por sí solo no induce descarga de desmonemes. Teniendo en cuenta que el comportamiento alimentario es regulado por varios mensajeros celulares actuando de manera coordinada, analizamos posibles interacciones funcionales entre un mensajero inhibitorio (i.e. AST-C), y los mensajeros estimuladores de la descarga (GSH, 5-HT y AT). Así la preincubación con AST-C, abolió la descarga inducida por AT, GSH y 5-HT. Estos resultados muestran que, al igual que para otros eventos del comportamiento alimentario (i.e. extrusión del hipostoma), mensajeros estimulatorios e inhibitorios podrían regular de forma coordinada la descarga de cnidocistos. Los aportes del presente trabajo incrementan el conocimiento acerca del mecanismo de descarga de cnidocistos en Hydra sp., proponiendo la relevancia de los estímulos químicos y las vías de señalización involucradas en este mecanismo. Además, proponemos que la descarga puede ser regulada por diferentes mensajeros químicos a través de vías de señalización canónicas asociadas a GPCR. Por último, y respecto a la recepción de estímulos mecánicos, proponemos la participación de los recientemente caracterizados canales mecano-sensibles Piezo en este mecanismo. Phylum Cnidaria is considered the sister group of Bilateria. It evolved 700 million years ago, and it might be considered one of the earliest groups of Metazoa with a nervous system. This phylum is defined by the presence of a unique cell type, the cnidocyte. The cnidocyte presents a capsular structure with a long tubule inside called cnidocyst, which is involved in several functions such as feeding, adhesion, defense and construction of structures where to dwell. This cell presents a sensory structure, the cnidocil, which has mechano and chemoreceptive functions. The species of genus Hydra (Hydrozoa: Hydridae), described by Trembley in 1744, are part of the forty groups of freshwater cnidarians. This organism has proved to be a useful and prolific biological research model in several fields such as aging, neurobiology, regeneration, ecotoxicology, developmental biology, evolution and physiology. Hydra presents four different types of cnidocysts: stenoteles (penetrant), desmonemes (volvent), which participate in prey capture, and isorhizas (atrichous and holotrichous), related to defense and adhesion. The tentacles have the highest density of cnidocytes. They are organized forming battery cell complexes that include cnidocytes associated with a myoepithelial cell and neurons. To regulate cnidocyst discharge, the complex integrates mechanical and chemical stimuli. Also, due to the innervation of different complexes in the same tentacle, the discharge of a single cnidocyst induce and synchronize the discharge of distant ones. Each cnidocyst can only be discharged once, and because of that this mechanism needs to be finely regulated being activated only by signals corresponding to the presence of the prey. It is assumed that the discharge of cnidocysts requires the combination of chemical signals, that sensitizes the cnidocyst, and mechanical ones which activate the mechanoreceptive system of the cnidocil. One of these chemical signals is the reduced glutathione (GSH), a tripeptide present in all animal cells released by the wounded prey. It has been proved to be responsible of inducing the feeding behavior in Hydra, including the cnidocyst discharge. On the basis of these studies, it has been proposed that GSH (and other natural compounds such as amino acids, sugars and nucleotides) can modulate the thresholds to mechanical stimuli but not induce the discharge by themselves. Beyond the stimuli involved in the discharge, the ion calcium (Ca2+) plays an important role in this process, and it has been proved that the cnidocyst discharge is calcium dependent. Several works developed in cnidarians show that the reduction on the availability of Ca2+ in the culture medium causes a decrease of the discharge. Cells have two ways to increase the cytosolic calcium concentration: by the influx from the extracellular medium and/or by its liberation from intracellular deposits. In sea anemones, it has been shown that the influx of Ca2+ occurs through L-type voltage gated calcium channels (VGCC), and in Hydra it might be mediated by transient receptor potential (TRP) channels. On the other hand, several studies have shown that the increase of the cytosolic calcium concentration also depends on its release from intracellular stores, as the endoplasmic reticulum. To maintain homeostasis, metazoans require mechanisms of intercellular communication. These communication systems have evolved from a common ancestor and have been conserved throughout evolution. In our laboratory, we study physiological and evolutionary aspects of communication systems based on neuropeptides in animal models such as Triatoma infestans and Rhodnius prolixus (Insecta: Hemiptera) and the freshwater cnidarian Hydra sp. Specifically, we study the pleiotropic neuropeptides allatotropin (AT) and allatostatin-C (AST-C), which act as mioregulators in different physiological systems. In Hydra, AT and AST-C act as mioregulators during feeding behavior. AT treatment on hydroids causes extrusion of the hypostome (a structure that contains the mouth), resembling the response caused by the presence of food. AST-C induces changes on the body length and in tentacle behavior and produces peristaltic waves in the gastrovascular cavity. In addition to these effects, it antagonizes AT and the feeding response, diminishing hypostome extrusion. The ancestral position of cnidarians gives us a valuable opportunity to study how communication systems have arisen and evolved. AT and AST-C receptors show a high degree of homology with the orexin and somatostatin systems in vertebrates, indicating that these systems have an early evolutionary origin and despite they acquired new roles, they also maintain the original ones. In the same way, the serotonin (5-HT) system is also widely distributed in nature. 5-HT is a biogenic amine, known in mammals as a regulator of the contraction of blood vessels and the peristalsis of the digestive tube, but also associated with functions in the central nervous system. Despite its role has been studied in different groups of invertebrates (mollusks, nematodes, annelids, arthropods), being associated with modulation of feeding, locomotion, circadian rhythms, diuresis and learning, this system has been poorly studied in non-bilaterians. In cnidarians, it has been proposed that 5-HT is involved in muscle contraction, cnidocyst discharge and the metamorphosis of the larva planula. Preliminary experiments performed in our laboratory suggest that 5-HT has mioregulatory functions related to feeding behavior in Hydra sp. However, the signaling pathways that this messenger would be activating are still unknown. The present Doctoral Thesis has as main objective to analyze the mechanisms that regulate the discharge of cnidocysts in Hydra sp. We looked for understanding the mechanisms of response of the cnidocyte to chemical and mechanical stimuli through the exposition of hydroids to natural stimuli such as living prey and/or chemical signals released by them. Beyond that, we studied the regulation of the discharge by cellular messengers such as 5-HT, AT and AST-C, and the signaling pathways activated. First, we performed the diagnosis at the specie level of two colonies of hydras maintained in our laboratory. Indeed, we measured the length and width of both the body column and undischarged cnidocyst capsules. The analysis of different morphological features allowed us to identify our colonies as Hydra viridissima and Hydra vulgaris. Considering that both mechanical and chemical stimuli are necessary to induce discharge, we analyzed the relevance of chemical stimuli on the discharge. To do that, we exposed hydroids to different stimuli: living prey (mechanical and chemical signal), its homogenate, and GSH (both chemical signals). All stimuli tested increased the number of desmonemes discharged, suggesting that chemical compounds (acting without a mechanical stimulation) induce the discharge by themselves. Once confirmed its stimulatory effect, we choose GSH to analyze the relevance of Ca2+ in this process and the specific signaling pathway driving the mechanism of discharge. Using calcium chelators, we verified that the mechanism triggered by GSH is associated with cytosolic calcium concentration. Using drugs that inhibit proteins pertaining to canonical signaling pathways, including GPCRs, we showed that GSH causes the influx of Ca2+ via L-type VGCC, but also by its release from the endoplasmic reticulum. Moreover, our results suggest that GSH acts associated with a GPCR coupled to a Gq, which produces IP3 as second messenger, increasing cytosolic Ca2+ concentration through IP3R. Regarding the influx of Ca2+ through L-type VGCC, bioinformatic analysis showed that the genome of Hydra vulgaris predicts the existence of the different subunits of L-type VGCC, showing a high level of conservation when compared with other groups of Metazoa. The discharge of cnidocyst is produced also by mechanical stimuli sensed by the cnidocil. Regarding the proteins involved, in Hydra sp., it has been reported that ectoderm expresses proteins associated with the sensing of mechanical stimuli, such as Piezo protein, a recently characterized mechano-sensitive channel. We wondered if these channels are associated with the discharged of cnidocysts. As a first approach we assayed Jedi1, a specific agonist of Piezo proteins, and gadolinium chloride (GdCl3), an unspecific inhibitor of mechano-sensitive channels. The number of desmonemes discharged was increased by Jedi1, being similar to the effect caused by GSH, while in the presence of GdCl3 the discharge induced by Jedi1 was inhibited. These results suggest that Piezo proteins are also involved in the cnidocyst discharge. The feeding behavior of Hydra consists of a series of complex behavioral sequences that involved the cnidocyst discharge as the first step. This behavior is regulated by chemical messengers which stimulate or inhibit the different stages of the feeding behavior. Considering the relevance of the regulation of the discharge, and that the messengers studied in our laboratory (5-HT, AT and AST-C) have activity over other steps of the feeding response, we evaluated their role on the regulation of the cnidocyst discharge and their interactions on a functional level. First, physiological experiments showed 5-HT stimulates the discharge. Then, we studied the signaling pathway associated with this amine. To do that, we used ion chelators and inhibitors of GPCRs, and the proteins involved in the canonic pathways of this kind of receptors. The results obtained showed that 5-HT acts increasing cytosolic calcium concentration by means of flux of this ion from the extracellular medium (not L-type VGCC involved) and its release from endoplasmic reticulum. The activated pathway would involve a GPCR coupled to a Gq protein. Furthermore, we evaluated the activity of the other two messengers (i.e. AT and AST-C) on the desmoneme discharge. To determine if AT is present in the cnidocysts, we performed an immunohistochemical analysis. The images obtained by means of confocal laser microscopy showed the colocalization of F-actin and AT in the cnidocysts of tentacles, suggesting that the peptide could be involved in the regulation of the cnidocyst discharge. By performing physiological assays, we observed that AT increases desmoneme discharge and it would be activating a signaling pathway involving the enzyme PLC and the synthesis of IP3. This signaling pathway was previously characterized by our lab on the process of hypostome extrusion. On the other hand, AST-C assays showed that the peptide by its own does not stimulate the discharge. Taking into consideration that the feeding behavior is regulated by several chemical messengers, we studied possible functional interactions between the inhibitory messenger AST-C and the stimulatory messengers of the discharge (GSH, 5-HT and AT). Using a protocol that included pre-incubation with AST-C, we observed that this peptide inhibited the desmoneme discharge induced by GSH, 5-HT and AT. These results showed that stimulatory and inhibitory messengers could be regulating the cnidocyst discharge in a coordinated way. The body of evidence presented in this work increases the knowledge we have about the cnidocyst discharge in Hydra sp., proposing the relevance of chemical stimuli and the signaling pathways involved in this mechanism. Also, we demonstrate that the discharge could be regulated by different chemical messengers which activate canonical signaling pathways associated with GPCRs. Finally, regarding the reception of mechanical stimuli, we proposed the involvement of the recently characterized Piezo proteins on the discharge. Doctor en Ciencias Naturales Universidad Nacional de La Plata Facultad de Ciencias Naturales y Museo
description	El phylum Cnidaria es considerado el grupo hermano de Bilateria. El origen de los cnidarios se remonta a 700 millones de años atrás y representa uno de los grupos más ancestrales de metazoos con sistema nervioso. La sinapomorfía que reúne a los miembros de este clado es la presencia de un tipo celular especializado conocido como cnidocito. El cnidocito contiene una estructura capsular con un filamento enrollado en su interior, el cnidocisto, el cual cumple funciones como defensa, captura de presas, adhesión al sustrato y construcción de estructuras en las que habitar. Además, desde la membrana de la célula, se proyecta el cnidocil, un complejo mecano-sensitivo cuya activación provoca la descarga del cnidocisto. Las especies del género Hydra (Hydrozoa: Hydridae), descrito por Trembley en 1744, forman parte de las 40 especies dulceacuícolas de cnidarios. Este organismo, ha resultado ser un eficiente y exitoso modelo biológico para el desarrollo de numerosas investigaciones, incluyendo estudios de envejecimiento, neurobiología, regeneración, ecotoxicología, biología del desarrollo, evolución y fisiología. Hydra posee cuatro tipos de cnidocistos: estenoteles, desmonemes, atricos isorrizas y holotricos isorrizas, de los cuales los dos primeros participan en la captura de presas, mientras que el tercer y cuarto tipo están involucrados en la adhesión al sustrato y la defensa, respectivamente. Los cnidocistos se ubican principalmente a nivel de los tentáculos, y se organizan formando los denominados “complejos de batería celular”. Cada complejo está formado por cnidocitos que se asocian a una célula epiteliomuscular y neuronas, e integra señales mecánicas y químicas del entorno, las cuales representan los estímulos que inducen su descarga. Además, dada la asociación de las baterías con células nerviosas, la estimulación de un cnidocisto causa también la descarga de otros ubicados a cierta distancia. Dado que la descarga del cnidocisto es un proceso irreversible, resulta fundamental que este mecanismo sea finamente regulado y se active sólo bajo las condiciones adecuadas. Se ha postulado que la descarga de los cnidocistos asociados a la captura de presas requiere de la presencia conjunta de estímulos químicos, encargados de sensibilizar al cnidocisto, y de estímulos mecánicos, que activan al sistema mecanorreceptor en el cnidocil. Dentro de las señales químicas que recibe el cnidocito se encuentra el glutatión reducido (GSH), un tripéptido contenido en todas las células animales, que es liberado cuando la presa es lastimada. Dicho compuesto ha demostrado estimular el comportamiento alimentario de Hydra, incluyendo la descarga de cnidocistos. A partir de estos estudios se ha propuesto que el GSH sensibiliza a la célula para reaccionar frente a un estímulo mecánico, pero no causaría la descarga por sí mismo. Más allá de los estímulos involucrados, se ha demostrado que la descarga es un proceso dependiente de calcio (Ca2+). Estudios realizados en hidrozoos y antozoos demuestran que la disminución de los niveles de Ca2+ extracelular inhibe la descarga. Las células disponen de dos mecanismos para aumentar la concentración citosólica de este ion: la entrada desde el medio extracelular y/o la liberación desde depósitos intracelulares. Respecto de los mecanismos relacionados con la descarga de cnidocistos, se ha observado en anémonas que la entrada de Ca2+ ocurre a través de canales dependientes de voltaje (VGCC) tipo L, mientras que, en Hydra sp., se propuso que el ingreso de calcio ocurre a través de un tipo de receptor de potencial transitorio (TRP). Además de su ingreso desde el medio extracelular, varios estudios muestran que el aumento de la concentración del Ca2+ citosólico depende además de su liberación desde el retículo endoplásmico (RE). Para mantener la homeostasis, los metazoos necesitan mecanismos de comunicación intercelular. Estos mecanismos de comunicación han evolucionado a partir de un ancestro común y se han conservado a lo largo de la evolución. En nuestro laboratorio estudiamos aspectos fisiológicos y evolutivos de sistemas de comunicación basados en neuropéptidos en modelos animales de insectos hemípteros (Triatoma infestans y Rhodnius prolixus) y el cnidario de agua dulce Hydra sp. Específicamente estudiamos los neuropéptidos pleiotrópicos allatotropina (AT) y allatostatina-C (AST-C), los cuales, entre otras funciones, son reguladores de la contracción muscular en diferentes sistemas fisiológicos. En Hydra, AT y AST-C actúan como mioreguladores durante el comportamiento alimentario. El tratamiento con AT provoca un incremento en la longitud del hipostoma (estructura donde se ubica la boca), mimetizando el efecto desencadenado por la presencia de alimento. Por su parte, AST-C tiene efecto en el largo del cuerpo, aumenta la actividad de los tentáculos y la actividad contráctil de la cavidad gastrovascular donde genera ondas peristálticas, similares a las desencadenadas luego de la ingesta. Además, este neuropéptido antagoniza el efecto de AT y del alimento sobre la extrusión del hipostoma. La posición basal de los cnidarios en el árbol filogenético nos provee una valiosa oportunidad para conocer el origen y la evolución de los sistemas de comunicación. Los receptores de AT y AST-C presentan un alto grado de homología con los de orexina y somatostatina en vertebrados, lo que muestra que estos sistemas surgieron tempranamente en la evolución, conservando los roles basales y adquiriendo nuevos. De igual forma, el sistema de serotonina (5-HT) es también un sistema ancestral y ampliamente distribuido en la naturaleza. 5-HT es una amina biogénica, conocida en mamíferos por su papel en la regulación de la contracción de la musculatura lisa vascular y la peristalsis del tubo digestivo, como así también, a nivel del sistema nervioso central en donde cumple distintas funciones. En invertebrados (moluscos, nematodes, anélidos, artrópodos), también se ha demostrado que interviene en funciones como la modulación de la alimentación, la locomoción, los ritmos circadianos, la diuresis y el aprendizaje, sin embargo, este sistema ha sido poco estudiado en metazoos basales. En cnidarios, se ha propuesto la participación de serotonina en la regulación de procesos como la contracción muscular, la descarga de cnidocistos y la metamorfosis de la larva plánula. Experimentos preliminares de nuestro laboratorio, sugieren que serotonina posee funciones mioregulatorias relacionadas al comportamiento alimentario en Hydra sp. Sin embargo, las vías de señalización que activaría este mensajero aún son desconocidas. El presente trabajo de Tesis Doctoral tiene como objetivo principal el análisis de los mecanismos que regulan la liberación de cnidocistos en Hydra sp. Se buscó comprender la respuesta frente a estímulos químicos y mecánicos a través de la exposición a estímulos naturales, como las presas vivas y/o señales químicas liberadas por estas al ser heridas. Estudiamos su regulación por mensajeros celulares como 5-HT, AT y AST-C y las correspondientes vías de señalización activadas. En primera instancia, se realizó la diagnosis a nivel específico de las dos colonias de hidras establecidas en nuestro laboratorio. La toma y posterior análisis de diferentes caracteres morfológicos permitió identificar a nuestras colonias como Hydra viridissima, e Hydra vulgaris. Con el objetivo de analizar la relevancia de los estímulos químicos sobre la descarga de cnidocistos, y teniendo en cuenta que se asume que es necesaria la exposición a estímulos químicos y mecánicos simultáneamente para activar este mecanismo, expusimos hidras a tres condiciones: i.e. larvas vivas de Artemia salina (estimulo mecánico y químico), homogenato de larvas de artemias y GSH (ambos estímulos exclusivamente químicos). Las tres condiciones generaron un aumento similar en la cantidad de desmonemes descargados, demostrando que, al menos en nuestro sistema de estudio, el estímulo químico por sí solo es suficiente para inducir la descarga. Una vez confirmado su efecto estimulatorio, elegimos al GSH para corroborar la dependencia de Ca2+ de este mecanismo y estudiar la vía de señalización activada por este compuesto. Mediante el uso de quelantes (BAPTA/AM y EDTA) verificamos que el GSH actúa aumentando la concentración citosólica de Ca2+. Asimismo, los resultados obtenidos a partir de los ensayos con EDTA, señalan que la entrada de Ca2+ a la célula es un mecanismo relevante para la liberación de desmonemes. A partir del uso de compuestos que modulan la actividad de receptores GPCR y de las proteínas involucradas en las cascadas de señalización canónicas, se demostró que el GSH provoca el ingreso de Ca2+ a través de canales VGCC tipo L, y su liberación desde depósitos intracelulares. Además, nuestros resultados sugieren que en la vía de acción de GSH está involucrada la activación de un GPCR, acoplado a proteína Gq, produciendo 1,4,5- inositol trifosfato (IP3) como segundo mensajero y la consiguiente salida de Ca2+ a través del receptor de IP3 (IP3R). Respecto de la entrada de Ca2+ mediada por VGCC tipo L, nuestros análisis bioinformáticos mostraron que el genoma de Hydra vulgaris predice la existencia de las diferentes subunidades de este tipo de canal, y que éstas presentan los motivos característicos conservados y un alto nivel de conservación respecto de los presentes en otros clados de metazoos, incluidos mamíferos. La descarga de cnidocistos es desencadenada por estímulos mecánicos que son sensados a nivel del cnidocil. Respecto de las proteínas involucradas en esta función, en Hydra sp., se ha demostrado que las células del ectodermo expresan diferentes proteínas mecano sensibles, entre ellas los canales Piezo. Con el objetivo de determinar si estos canales están involucrados en el proceso de descarga de cnidocistos, utilizamos un agonista específico de éstos (Jedi1), y tricloruro de gadolinio (GdCl3), un inhibidor inespecífico de canales mecano-sensibles. La cantidad de desmonemes disparados por efecto del agonista, se asemejó a los valores producidos por el GSH, mientras que en presencia de GdCl3, la descarga inducida por Jedi1 fue inhibida, sugiriendo la participación de canales Piezo en el proceso. El comportamiento alimentario de Hydra consiste en una serie de complejas secuencias comportamentales que incluyen a la descarga de cnidocistos como primer paso. Dicho comportamiento está regulado por diferentes mensajeros químicos, los cuales estimulan o inhiben las distintas etapas. Teniendo en consideración la importancia de regular la liberación de cnidocistos, y que los mensajeros estudiados en nuestro laboratorio (5-HT, AT y AST-C) participan en la regulación de otras de las etapas del comportamiento alimentario, evaluamos su rol en la descarga y sus interacciones a nivel funcional. En primer lugar, los experimentos fisiológicos mostraron que 5-HT induce la descarga de desmonemes. Posteriormente, se estudió la vía de señalización de 5-HT, para lo que utilizamos quelantes y compuestos inhibidores de GPCRs y de las proteínas involucradas en sus vías canónicas de transducción. A partir de los resultados obtenidos, proponemos que 5-HT estimula la descarga de desmonemes generando un aumento en la concentración citosólica de Ca2+ mediante la entrada de este ion desde el medio extracelular (que no involucra un VGCC tipo L), y su liberación desde el RE. Asimismo, en la vía activada participa un receptor GPCR (asociado a proteína Gq). Luego, se evaluó el rol de los neuropéptidos AT y AST-C sobre la descarga de desmonemes. Primeramente, análisis inmunohistoquímicos y microscopía de barrido laser confocal mostraron la colocalización de Actina-F y AT en los cnidocistos de los tentáculos, sugiriendo que el péptido podría estar involucrado en la regulación de la descarga. Además, mediante ensayos fisiológicos, observamos que AT incrementa la descarga de desmonemes, activando una vía de señalización que involucra la enzima fosfolipasa C (PLC) y la producción de IP3, la cual fue previamente caracterizada en la estimulación de la extrusión del hipostoma. Por otro lado, los experimentos fisiológicos también mostraron que AST-C por sí solo no induce descarga de desmonemes. Teniendo en cuenta que el comportamiento alimentario es regulado por varios mensajeros celulares actuando de manera coordinada, analizamos posibles interacciones funcionales entre un mensajero inhibitorio (i.e. AST-C), y los mensajeros estimuladores de la descarga (GSH, 5-HT y AT). Así la preincubación con AST-C, abolió la descarga inducida por AT, GSH y 5-HT. Estos resultados muestran que, al igual que para otros eventos del comportamiento alimentario (i.e. extrusión del hipostoma), mensajeros estimulatorios e inhibitorios podrían regular de forma coordinada la descarga de cnidocistos. Los aportes del presente trabajo incrementan el conocimiento acerca del mecanismo de descarga de cnidocistos en Hydra sp., proponiendo la relevancia de los estímulos químicos y las vías de señalización involucradas en este mecanismo. Además, proponemos que la descarga puede ser regulada por diferentes mensajeros químicos a través de vías de señalización canónicas asociadas a GPCR. Por último, y respecto a la recepción de estímulos mecánicos, proponemos la participación de los recientemente caracterizados canales mecano-sensibles Piezo en este mecanismo.
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Análisis de los mecanismos asociados a la descarga de cnidocistos y su regulación en Hydra

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