Desarrollo de ELISA competitivos indirectos con sueros hiperinmune de gallina para la detección de proteínas lácteas: una herramienta versátil para alimentos, suplementos y cosméti...

Autores: Rocha, Lucía Alejandra; Parreño, Gladys Viviana; Polenta, Gustavo Alberto; Ambrosi, Vanina; Lang, Maria Cecilia
Año de publicación: 2025
Idioma: español castellano
Tipo de recurso: documento de conferencia
Estado: versión publicada
Descripción: Póster
La detección de proteínas lácteas en alimentos es fundamental para garantizar la calidad, verificar el etiquetado y proteger a consumidores con alergias alimentarias. En este trabajo se presentan los resultados iniciales del desarrollo de tres ensayos de ELISA competitivos indirectos orientados a la detección de alfalactoalbúmina (ALA), betalactoglobulina (BLG) y beta caseínas (BCAS) bovinas, utilizando sueros policlonales obtenidos en de gallina. El objetivo fue desarrollar ensayos de ELISA competitivos indirectos basados en estos anticuerpos y evaluar su desempeño utilizando leche descremada como matriz modelo, con vistas a su futura aplicación en alimentos, suplementos y cosméticos de mayor complejidad. Para ello se hiperinmunizaron 3 grupos de 2 gallinas con 5 dosis de 30 ug/ dosis de ALA, BLG y BCAS. Un cuarto grupo no inmunizado se utilizó como control. Tras la quinta dosis se evaluó la respuesta de los sueros policlonales frente al antígeno correspondiente. Cada ensayo fue optimizado individualmente, utilizando placas de poliestireno de origen nacional (IVEMA), ajustando la concentración del antígeno inmovilizado (0,5 µg/mL) y la dilución del suero policlonal de gallina obtenido para cada proteína. El principio del ELISA competitivo indirecto se basa en la competencia entre las proteínas (antígenos) presentes en una muestra problema y el antígeno inmovilizado en la placa por la unión a los anticuerpos. Se realizaron 7 diluciones seriadas base 4 de leche descremada comercial en buffer fosfato salino (PBS). Cada dilución se enfrentó con un pool de sueros de dos gallinas por alérgeno, correspondientes a la quinta inmunización. Las mezclas fueron preincubardas a 37°C en placas sustitutas y luego transferidas a las placas de reacción previamente recubiertas con el antígeno de interés y bloqueadas con gelatina 2%. La detección se realizó utilizando un anticuerpo de conejo anti-gallina conjugado a HRP (1:5000), y el revelado mediante desarrollo cromogénico usando ABTS como sustrato. Los resultados preliminares muestran que en los tres ensayos los sueros fueron capaces de detectar en un rango lineal diluciones de leche comercial de entre 1:1000 y 1:256000, detectando concentraciones estimadas de 20,6 ng/ml para ALA, 34,4 ng/ml de BCAS y hasta 13 ng/ml de BLG. Los tres ELISA competitivos indirectos desarrollados constituyen herramientas viables para la detección de proteínas lácteas, con buen desempeño preliminar en una matriz modelo. La utilización de gallinas como fuente de anticuerpos permitió obtener sueros policlonales específicos y estables, y plantea la posibilidad de purificar IgY a partir de yema de huevo, lo que contribuiría a una producción no invasiva, sustentable y de bajo costo, con ventajas en bienestar animal y menor reactividad cruzada con proteínas séricas de mamíferos. Si bien se requiere continuar con la optimización de los ensayos y validar su desempeño frente a proteínas purificadas y matrices reales más complejas, los resultados obtenidos son alentadores para su futura implementación en sistemas de control de alérgenos en alimentos, suplementos, productos farmacéuticos y cosméticos.
The detection of dairy proteins in food is essential to guarantee quality, verify labeling, and protect consumers with food allergies. This work presents the initial results of the development of three indirect competitive ELISA assays aimed at detecting bovine alpha-lactalbumin (ALA), beta-lactoglobulin (BLG), and beta-casein (BCAS), using polyclonal sera obtained in hens. The objective was to develop indirect competitive ELISA assays based on these antibodies and evaluate their performance using skim milk as a model matrix, with a view to their future application in more complex foods, supplements, and cosmetics. For this purpose, three groups of two hens each were hyperimmunized with five doses of 30 µg/dose of ALA, BLG, and BCAS. A fourth non-immunized group was used as a control. Following the fifth dose, the response of the polyclonal sera against the corresponding antigen was evaluated. Each assay was individually optimized using domestically manufactured polystyrene plates (IVEMA), adjusting the concentration of the immobilized antigen (0.5 µg/mL) and the dilution of the polyclonal hen serum obtained for each protein. The principle of the indirect competitive ELISA is based on the competition between the proteins (antigens) present in a test sample and the antigen immobilized on the plate for binding to the antibodies. Seven 4-fold serial dilutions of commercial skim milk in phosphate-buffered saline (PBS) were prepared. Each dilution was incubated with a pool of sera from two hens per allergen, corresponding to the fifth immunization. The mixtures were pre-incubated at 37°C in donor plates and then transferred to the reaction plates, which had been previously coated with the antigen of interest and blocked with 2% gelatin. Detection was performed using an HRP-conjugated rabbit anti-hen antibody (1:5000), and visualization was achieved through chromogenic development using ABTS as a substrate. Preliminary results show that in all three assays, the sera were able to detect commercial milk dilutions within a linear range between 1:1,000 and 1:256,000, detecting estimated concentrations of 20.6 ng/mL for ALA, 34.4 ng/mL for BCAS, and up to 13 ng/mL for BLG. The three indirect competitive ELISAs developed represent viable tools for detecting dairy proteins, showing good preliminary performance in a model matrix. The use of hens as an antibody source yielded specific and stable polyclonal sera and opens the possibility of purifying IgY from egg yolk, which would contribute to a non-invasive, sustainable, and low-cost production method with animal welfare advantages and lower cross-reactivity with mammalian serum proteins. Although further optimization of the assays and performance validation against purified proteins and more complex real matrices are required, the results obtained are encouraging for their future implementation in allergen control systems across food, dietary supplements, pharmaceuticals, and cosmetics.
Instituto de Virología e Innovaciones Tecnológicas (IVIT)
Fil: Rocha, Lucía Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología e Innovaciones Tecnológicas (IVIT); Argentina.
Fil: Rocha, Lucía Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). IncuINTA; Argentina.
Fil: Lang, Maria Cecilia. Vetanco argentina; Argentina.
Fil: Parreño, Gladys Viviana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología e Innovaciones Tecnológicas (IVIT); Argentina.
Fil: Parreño, Gladys Viviana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). IncuINTA; Argentina.
Fil: Parreño, Gladys Viviana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina.
Fil: Polenta, Gustavo Alberto. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto Tecnología de Alimentos (ITA); Argentina.
Fil: Polenta, Gustavo Alberto. Instituto de Ciencia y Tecnología de Sistemas Alimentarios Sustentables (ICyTeSAS) UEDD INTA CONICET; Argentina.
Fil: Polenta, Gustavo Alberto. Universidad Nacional de Luján; Argentina.
Fil: Ambrosi, Vanina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto Tecnología de Alimentos (ITA); Argentina.
Fil: Ambrosi, Vanina. Instituto de Ciencia y Tecnología de Sistemas Alimentarios Sustentables (ICyTeSAS) UEDD INTA CONICET; Argentina.
Fil: Ambrosi, Vanina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina.
Fil: Ambrosi, Vanina. Universidad de Morón. Escuela Superior de Ingeniería, Informática y Ciencias Agroalimentarias (ESIICA); Argentina.
Fuente: XIX Congreso de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CYTAL) 2025: “Alimentos del futuro: innovación, sostenibilidad y salud”. Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina, 12 al 14 de noviembre de 2025
Materia: Food Allergies
Milk Protein
Polyclonal Antibodies
ELISA
Immunoglobulins
Hens
Immune Serum
Foods
Food Supplements
Alergia Alimentaria
Proteínas de la Leche
Anticuerpos Policlonales
Inmunoglobulina
Gallinas
Suero Inmune
Alimentos
Suplemento Alimentario
Nivel de accesibilidad: acceso abierto
Condiciones de uso: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/
Repositorio
Institución: Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria
OAI Identificador: oai:localhost:20.500.12123/27612

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El objetivo fue desarrollar ensayos de ELISA competitivos indirectos basados en estos anticuerpos y evaluar su desempeño utilizando leche descremada como matriz modelo, con vistas a su futura aplicación en alimentos, suplementos y cosméticos de mayor complejidad. Para ello se hiperinmunizaron 3 grupos de 2 gallinas con 5 dosis de 30 ug/ dosis de ALA, BLG y BCAS. Un cuarto grupo no inmunizado se utilizó como control. Tras la quinta dosis se evaluó la respuesta de los sueros policlonales frente al antígeno correspondiente. Cada ensayo fue optimizado individualmente, utilizando placas de poliestireno de origen nacional (IVEMA), ajustando la concentración del antígeno inmovilizado (0,5 µg/mL) y la dilución del suero policlonal de gallina obtenido para cada proteína. El principio del ELISA competitivo indirecto se basa en la competencia entre las proteínas (antígenos) presentes en una muestra problema y el antígeno inmovilizado en la placa por la unión a los anticuerpos. Se realizaron 7 diluciones seriadas base 4 de leche descremada comercial en buffer fosfato salino (PBS). Cada dilución se enfrentó con un pool de sueros de dos gallinas por alérgeno, correspondientes a la quinta inmunización. Las mezclas fueron preincubardas a 37°C en placas sustitutas y luego transferidas a las placas de reacción previamente recubiertas con el antígeno de interés y bloqueadas con gelatina 2%. La detección se realizó utilizando un anticuerpo de conejo anti-gallina conjugado a HRP (1:5000), y el revelado mediante desarrollo cromogénico usando ABTS como sustrato. Los resultados preliminares muestran que en los tres ensayos los sueros fueron capaces de detectar en un rango lineal diluciones de leche comercial de entre 1:1000 y 1:256000, detectando concentraciones estimadas de 20,6 ng/ml para ALA, 34,4 ng/ml de BCAS y hasta 13 ng/ml de BLG. Los tres ELISA competitivos indirectos desarrollados constituyen herramientas viables para la detección de proteínas lácteas, con buen desempeño preliminar en una matriz modelo. La utilización de gallinas como fuente de anticuerpos permitió obtener sueros policlonales específicos y estables, y plantea la posibilidad de purificar IgY a partir de yema de huevo, lo que contribuiría a una producción no invasiva, sustentable y de bajo costo, con ventajas en bienestar animal y menor reactividad cruzada con proteínas séricas de mamíferos. Si bien se requiere continuar con la optimización de los ensayos y validar su desempeño frente a proteínas purificadas y matrices reales más complejas, los resultados obtenidos son alentadores para su futura implementación en sistemas de control de alérgenos en alimentos, suplementos, productos farmacéuticos y cosméticos.The detection of dairy proteins in food is essential to guarantee quality, verify labeling, and protect consumers with food allergies. This work presents the initial results of the development of three indirect competitive ELISA assays aimed at detecting bovine alpha-lactalbumin (ALA), beta-lactoglobulin (BLG), and beta-casein (BCAS), using polyclonal sera obtained in hens. The objective was to develop indirect competitive ELISA assays based on these antibodies and evaluate their performance using skim milk as a model matrix, with a view to their future application in more complex foods, supplements, and cosmetics. For this purpose, three groups of two hens each were hyperimmunized with five doses of 30 µg/dose of ALA, BLG, and BCAS. A fourth non-immunized group was used as a control. Following the fifth dose, the response of the polyclonal sera against the corresponding antigen was evaluated. Each assay was individually optimized using domestically manufactured polystyrene plates (IVEMA), adjusting the concentration of the immobilized antigen (0.5 µg/mL) and the dilution of the polyclonal hen serum obtained for each protein. The principle of the indirect competitive ELISA is based on the competition between the proteins (antigens) present in a test sample and the antigen immobilized on the plate for binding to the antibodies. Seven 4-fold serial dilutions of commercial skim milk in phosphate-buffered saline (PBS) were prepared. Each dilution was incubated with a pool of sera from two hens per allergen, corresponding to the fifth immunization. The mixtures were pre-incubated at 37°C in donor plates and then transferred to the reaction plates, which had been previously coated with the antigen of interest and blocked with 2% gelatin. Detection was performed using an HRP-conjugated rabbit anti-hen antibody (1:5000), and visualization was achieved through chromogenic development using ABTS as a substrate. Preliminary results show that in all three assays, the sera were able to detect commercial milk dilutions within a linear range between 1:1,000 and 1:256,000, detecting estimated concentrations of 20.6 ng/mL for ALA, 34.4 ng/mL for BCAS, and up to 13 ng/mL for BLG. The three indirect competitive ELISAs developed represent viable tools for detecting dairy proteins, showing good preliminary performance in a model matrix. The use of hens as an antibody source yielded specific and stable polyclonal sera and opens the possibility of purifying IgY from egg yolk, which would contribute to a non-invasive, sustainable, and low-cost production method with animal welfare advantages and lower cross-reactivity with mammalian serum proteins. Although further optimization of the assays and performance validation against purified proteins and more complex real matrices are required, the results obtained are encouraging for their future implementation in allergen control systems across food, dietary supplements, pharmaceuticals, and cosmetics.Instituto de Virología e Innovaciones Tecnológicas (IVIT)Fil: Rocha, Lucía Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología e Innovaciones Tecnológicas (IVIT); Argentina.Fil: Rocha, Lucía Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). IncuINTA; Argentina.Fil: Lang, Maria Cecilia. Vetanco argentina; Argentina.Fil: Parreño, Gladys Viviana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología e Innovaciones Tecnológicas (IVIT); Argentina.Fil: Parreño, Gladys Viviana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). IncuINTA; Argentina.Fil: Parreño, Gladys Viviana. 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Escuela Superior de Ingeniería, Informática y Ciencias Agroalimentarias (ESIICA); Argentina.Asociación Argentina de Tecnólogos Alimentarios (AATA)2026-09-02T11:45:58Z2026-09-02T11:45:58Z2025-11info:eu-repo/semantics/conferenceObjectinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionhttp://purl.org/coar/resource_type/c_5794info:ar-repo/semantics/documentoDeConferenciaapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/20.500.12123/27612XIX Congreso de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CYTAL) 2025: “Alimentos del futuro: innovación, sostenibilidad y salud”. 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Tras la quinta dosis se evaluó la respuesta de los sueros policlonales frente al antígeno correspondiente. Cada ensayo fue optimizado individualmente, utilizando placas de poliestireno de origen nacional (IVEMA), ajustando la concentración del antígeno inmovilizado (0,5 µg/mL) y la dilución del suero policlonal de gallina obtenido para cada proteína. El principio del ELISA competitivo indirecto se basa en la competencia entre las proteínas (antígenos) presentes en una muestra problema y el antígeno inmovilizado en la placa por la unión a los anticuerpos. Se realizaron 7 diluciones seriadas base 4 de leche descremada comercial en buffer fosfato salino (PBS). Cada dilución se enfrentó con un pool de sueros de dos gallinas por alérgeno, correspondientes a la quinta inmunización. Las mezclas fueron preincubardas a 37°C en placas sustitutas y luego transferidas a las placas de reacción previamente recubiertas con el antígeno de interés y bloqueadas con gelatina 2%. La detección se realizó utilizando un anticuerpo de conejo anti-gallina conjugado a HRP (1:5000), y el revelado mediante desarrollo cromogénico usando ABTS como sustrato. Los resultados preliminares muestran que en los tres ensayos los sueros fueron capaces de detectar en un rango lineal diluciones de leche comercial de entre 1:1000 y 1:256000, detectando concentraciones estimadas de 20,6 ng/ml para ALA, 34,4 ng/ml de BCAS y hasta 13 ng/ml de BLG. Los tres ELISA competitivos indirectos desarrollados constituyen herramientas viables para la detección de proteínas lácteas, con buen desempeño preliminar en una matriz modelo. La utilización de gallinas como fuente de anticuerpos permitió obtener sueros policlonales específicos y estables, y plantea la posibilidad de purificar IgY a partir de yema de huevo, lo que contribuiría a una producción no invasiva, sustentable y de bajo costo, con ventajas en bienestar animal y menor reactividad cruzada con proteínas séricas de mamíferos. Si bien se requiere continuar con la optimización de los ensayos y validar su desempeño frente a proteínas purificadas y matrices reales más complejas, los resultados obtenidos son alentadores para su futura implementación en sistemas de control de alérgenos en alimentos, suplementos, productos farmacéuticos y cosméticos. The detection of dairy proteins in food is essential to guarantee quality, verify labeling, and protect consumers with food allergies. This work presents the initial results of the development of three indirect competitive ELISA assays aimed at detecting bovine alpha-lactalbumin (ALA), beta-lactoglobulin (BLG), and beta-casein (BCAS), using polyclonal sera obtained in hens. The objective was to develop indirect competitive ELISA assays based on these antibodies and evaluate their performance using skim milk as a model matrix, with a view to their future application in more complex foods, supplements, and cosmetics. For this purpose, three groups of two hens each were hyperimmunized with five doses of 30 µg/dose of ALA, BLG, and BCAS. A fourth non-immunized group was used as a control. Following the fifth dose, the response of the polyclonal sera against the corresponding antigen was evaluated. Each assay was individually optimized using domestically manufactured polystyrene plates (IVEMA), adjusting the concentration of the immobilized antigen (0.5 µg/mL) and the dilution of the polyclonal hen serum obtained for each protein. The principle of the indirect competitive ELISA is based on the competition between the proteins (antigens) present in a test sample and the antigen immobilized on the plate for binding to the antibodies. Seven 4-fold serial dilutions of commercial skim milk in phosphate-buffered saline (PBS) were prepared. Each dilution was incubated with a pool of sera from two hens per allergen, corresponding to the fifth immunization. The mixtures were pre-incubated at 37°C in donor plates and then transferred to the reaction plates, which had been previously coated with the antigen of interest and blocked with 2% gelatin. Detection was performed using an HRP-conjugated rabbit anti-hen antibody (1:5000), and visualization was achieved through chromogenic development using ABTS as a substrate. Preliminary results show that in all three assays, the sera were able to detect commercial milk dilutions within a linear range between 1:1,000 and 1:256,000, detecting estimated concentrations of 20.6 ng/mL for ALA, 34.4 ng/mL for BCAS, and up to 13 ng/mL for BLG. The three indirect competitive ELISAs developed represent viable tools for detecting dairy proteins, showing good preliminary performance in a model matrix. The use of hens as an antibody source yielded specific and stable polyclonal sera and opens the possibility of purifying IgY from egg yolk, which would contribute to a non-invasive, sustainable, and low-cost production method with animal welfare advantages and lower cross-reactivity with mammalian serum proteins. Although further optimization of the assays and performance validation against purified proteins and more complex real matrices are required, the results obtained are encouraging for their future implementation in allergen control systems across food, dietary supplements, pharmaceuticals, and cosmetics. Instituto de Virología e Innovaciones Tecnológicas (IVIT) Fil: Rocha, Lucía Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología e Innovaciones Tecnológicas (IVIT); Argentina. Fil: Rocha, Lucía Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). IncuINTA; Argentina. Fil: Lang, Maria Cecilia. Vetanco argentina; Argentina. Fil: Parreño, Gladys Viviana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología e Innovaciones Tecnológicas (IVIT); Argentina. Fil: Parreño, Gladys Viviana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). IncuINTA; Argentina. Fil: Parreño, Gladys Viviana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Fil: Polenta, Gustavo Alberto. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto Tecnología de Alimentos (ITA); Argentina. Fil: Polenta, Gustavo Alberto. Instituto de Ciencia y Tecnología de Sistemas Alimentarios Sustentables (ICyTeSAS) UEDD INTA CONICET; Argentina. Fil: Polenta, Gustavo Alberto. Universidad Nacional de Luján; Argentina. Fil: Ambrosi, Vanina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto Tecnología de Alimentos (ITA); Argentina. Fil: Ambrosi, Vanina. Instituto de Ciencia y Tecnología de Sistemas Alimentarios Sustentables (ICyTeSAS) UEDD INTA CONICET; Argentina. Fil: Ambrosi, Vanina. 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